一種固定化脂肪酶催化合成綠原酸植物甾醇酯的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開了一種固定化脂肪酶催化合成綠原酸植物留醇酯的方法，屬于植物甾醇酯領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]植物留醇是一種十分重要的具有生理活性的化合物，廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品和食品等行業(yè)。植物留醇和植物留醇酯的生理功能包括:可以降低血液中的膽固醇濃度、可以預(yù)防前列腺疾病、可以作為抗癌物質(zhì)、有類激素作用、具有促進(jìn)動物生長、退熱和抗炎作用、皮膚美容和保健等其他作用。植物留醇的油溶性差，為了能夠在食品加工中應(yīng)用，需要改變植物留醇的形式并且不影響植物留醇的生理功能。植物留醇脂肪酸酯大大改善了植物甾醇的脂溶性。
[0003]植物留醇酯的合成一般有兩種:化學(xué)法和生物酶法:化學(xué)法不僅能耗高，而且在高溫下易造成脂肪酸的分解，陳茂彬等采取化學(xué)方法合成植物留醇油酸酯和植物留醇硬脂酸酯，反應(yīng)溫度高，不飽和脂肪酸容易氧化產(chǎn)生副產(chǎn)物;此外，王明霞等采取微波加熱催化合成α-亞麻酸植物留醇酯，操作簡單，反應(yīng)時間短，無溶劑污染，但是產(chǎn)物顏色較深，副產(chǎn)物較多。生物酶法催化條件溫和、反應(yīng)選擇性高、產(chǎn)品比較環(huán)保，因此廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)。目前，國內(nèi)已有利用共軛亞油酸、亞麻酸和月桂酸與植物留醇催化合成植物甾醇酯的報道，對棕櫚酸植物留醇酯的合成尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題:針對目前化學(xué)方法合成植物留醇酯不僅能耗高，而且在高溫下易造成脂肪酸的分解，不飽和脂肪酸容易氧化產(chǎn)生副產(chǎn)物，而且植物留醇的水不溶性和低油溶性的問題，提供了一種固定化脂肪酶催化合成綠原酸植物留醇酯的方法，本發(fā)明先從玉米中通過酶解、超臨界CO2萃取得植物留醇，再從菊花中提取出綠原酸，以固定化脂肪酶為催化劑，將植物留醇和綠原酸進(jìn)行酯化反應(yīng)，得植物留醇酯，最后純化即可，本發(fā)明采用生物酶法催化條件溫和、反應(yīng)選擇性高，而且克服了游離植物留醇在水和油脂中溶解性差和活性低的問題。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(1)選取200?300g干燥后的玉米，將其研磨，過100?120目篩得玉米粉末，將玉米粉末加入5L反應(yīng)爸中，并向反應(yīng)爸中加入總質(zhì)量5?8%復(fù)合酶，再按固液比1:10?1:15加入質(zhì)量濃度15%鹽酸溶液，混合攪拌均勻，將反應(yīng)釜升溫至45?60°C，進(jìn)行酶解3?5h，將酶解液過濾取濾渣，所述的復(fù)合酶是按質(zhì)量比3:2的纖維素酶和蛋白質(zhì)酶進(jìn)行混合；
(2)將上述得到的濾渣用榨汁機(jī)榨出多余水分，將榨完后的渣用超臨界CO2在室溫下進(jìn)行萃取，萃取壓力為5?20MPa，二氧化碳流量為160?180kg/h，萃取I?2h后，從流體相中分離得到甾醇固體，甾取，備用；
(3)取50?60g菊花花瓣，先粉碎過60?80目篩，再將粉末置于300?500mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%乙醇溶液中，攪拌后移入超聲提取裝置中，在60?65°C和80?120W下進(jìn)行提取2?3h，得提取液，將提取液在4000?5000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離，取上清液，將上清液移入圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50?55°C下蒸發(fā)濃縮至乙醇完全去除，將濃縮液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，按體積比1:2加入石油醚進(jìn)行脫色2?3次，分層得水相，再用乙酸乙酯萃取3?5次，取下層液體，即為綠原酸；
(4)取2?3g步驟(2)的甾醇于250mL錐形瓶中，按固液1:2?1:6向瓶中加入上述綠原酸，攪拌混合后再加入總質(zhì)量4?10%固定化脂肪酶為催化劑、0.1?0.3g二十六烷為內(nèi)標(biāo)和40?50mL甲醇為溶劑，將錐形瓶放入恒溫振蕩器中，在40?65°C和80?120r/min下進(jìn)行酯化反應(yīng)3?5h;
(5)將上述酯化反應(yīng)后的混合物按體積比1:5?1:8溶于正己烷中，用硅膠柱層析分離，分離后收集洗脫液，并在65?70°C進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到綠原酸留醇酯濃縮液，將濃縮液在45?55°C下干燥6?Sh得到綠原酸留醇酯粉末狀固體。
[0006]本發(fā)明制備的方法:本發(fā)明制得的綠原酸植物甾醇酯可以添加到保健品，起到降低血膽固醇、消炎、退熱和抗氧化作用，添加到食品中，可以提高抗氧化能力，延長食品食用期時間。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明采用生物酶法催化條件溫和、反應(yīng)選擇性高，得到的產(chǎn)品具有廣泛的應(yīng)用；
(2)本發(fā)明克服了游離植物留醇在水和油脂中溶解性差和活性低的問題，而且原料來源豐富，成本低廉。
【具體實(shí)施方式】
[0008]首先選取200?300g干燥后的玉米，將其研磨，過100?120目篩得玉米粉末，將玉米粉末加入5L反應(yīng)爸中，并向反應(yīng)Il中加入總質(zhì)量5?8%復(fù)合酶，再按固液比1:10?1:15加入質(zhì)量濃度15%鹽酸溶液，混合攪拌均勻，將反應(yīng)釜升溫至45?60°C，進(jìn)行酶解3?5h，將酶解液過濾取濾渣，所述的復(fù)合酶是按質(zhì)量比3:2的纖維素酶和蛋白質(zhì)酶進(jìn)行混合;將得到的濾渣用榨汁機(jī)榨出多余水分，將榨完后的渣用超臨界CO2在室溫下進(jìn)行萃取，萃取壓力為5?20MPa，二氧化碳流量為160?180kg/h，萃取I?2h后，從流體相中分離得到甾醇固體，甾取，備用；取50?60g菊花花瓣，先粉碎過60?80目篩，再將粉末置于300?500mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)85%乙醇溶液中，攪拌后移入超聲提取裝置中，在60?65°C和80?120W下進(jìn)行提取2?3h，得提取液，將提取液在4000?5000r/min轉(zhuǎn)速下離心分離，取上清液，將上清液移入圓底燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50?55°C下蒸發(fā)濃縮至乙醇完全去除，將濃縮液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，按體積比1:2加入石油醚進(jìn)行脫色2?3次，分層得水相，再用乙酸乙酯萃取3?5次，取下層液體，即為綠原酸；取2?3g甾醇于250mL錐形瓶中，按固液1: 2?1:6向瓶中加入上述綠原酸，攪拌混合后再加入總質(zhì)量4?10%固定化脂肪酶為催化劑、0.1?0.3g二十六烷為內(nèi)標(biāo)和40?50mL甲醇為溶劑，將錐形瓶放入恒溫振蕩器中，在40?65°C和80?120r/min下進(jìn)行酯化反應(yīng)3?5h;將酯化反應(yīng)后的混合物按體積比1: 5?1:8溶于正己烷中，用硅膠柱層析分離，分離后收集洗脫液，并在65?70°C進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到綠原酸留醇酯濃縮液，將濃縮液在45?55°C下干燥6?Sh得到綠原酸留醇酯粉末狀固體。
[0009]實(shí)例I 首先選取200g干燥后的玉米，將其研磨，過100目篩得玉米粉末，將玉米粉末加入5L反應(yīng)釜中，并向反應(yīng)釜中加入總質(zhì)量5%復(fù)合酶，再按固液比1:1O加入質(zhì)量濃度15%鹽酸溶液，混合攪拌均勻，將反應(yīng)釜升溫至45°C，進(jìn)行酶解3h，將酶解液過濾取濾渣，所述的復(fù)合酶是按質(zhì)量比3:2的纖維素酶和蛋白質(zhì)酶進(jìn)行混合;將得到的濾渣用榨汁機(jī)榨出多余水分，將榨完后的渣用超臨界CO2在室溫下進(jìn)行萃取，萃取壓力為5MPa，二氧化碳流量為160kg/h，萃取Ih后，從流體相中分離得到留醇固體，留取，備用;取50g菊花花