一種快速檢測痰液中結(jié)核分支桿菌的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生物檢測技術(shù)，具體涉及一種快速檢測痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)，俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。據(jù)WHO報道，每年約有800萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病。我國建國前死亡率達(dá)200-300人/10萬，居各種疾病死亡原因之首，建國后人民生活水平提高，衛(wèi)生狀態(tài)改善，特別是開展了群防群治，兒童普遍接種卡介苗，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率大為降低。但應(yīng)注意，世界上有些地區(qū)因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑的應(yīng)用、酗酒和貧困等原因，發(fā)病率又有上升趨勢。因此，對結(jié)核分枝桿菌的及時、高效、特異性的檢測成為預(yù)防、治療結(jié)核分枝桿菌引起病癥的有效手段。
[0003]細(xì)菌培養(yǎng)和涂片檢查是應(yīng)用最為廣泛的病原學(xué)診斷技術(shù)之一，其中痰液培養(yǎng)約占50%以上。痰液標(biāo)本檢驗對于呼吸道疾病的診斷和鑒別具有重要的臨床意義。正常人下呼吸道是無菌的，當(dāng)人體的肺部或支氣管發(fā)生細(xì)菌性感染時，痰液分泌量會明顯增加。經(jīng)痰液細(xì)菌培養(yǎng)，分離出病原菌，有助于對下呼吸道感染性疾病的診斷和治療。經(jīng)痰液培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)常見的致病菌:
革蘭陽性菌:肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、結(jié)核分枝桿菌、放線菌、奴卡菌、厭氧球菌、白喉棒狀桿菌等；
革蘭陰性菌:卡他布蘭漢菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、肺炎克雷伯菌、腸桿菌、假單胞菌、軍團(tuán)菌等。
[0004]傳統(tǒng)習(xí)慣程序的痰液標(biāo)本細(xì)菌學(xué)檢驗其臨床符合率并不高，其原因是多方面的。除了痰標(biāo)本采集不規(guī)范導(dǎo)致的不合格標(biāo)本帶來的培養(yǎng)結(jié)果與病人感染不相符外，還因為微生物和人體的相關(guān)性本身就具有復(fù)雜性:源自細(xì)菌的致病與條件致病的辨證性，如致病菌可能為正常攜帶，而細(xì)菌在肺通氣功能異常病人的下呼吸道的可以發(fā)生單純定植或感染，要證明培養(yǎng)結(jié)果與感染的相關(guān)性是醫(yī)學(xué)微生物學(xué)所面臨的難題，這也使得一直以來在對于痰培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)展十分緩慢。
[0005]痰液細(xì)菌培養(yǎng)陽性率普遍較低，臨床符合率差的關(guān)鍵因素是痰標(biāo)本采集不規(guī)范，不合格痰標(biāo)本將直接導(dǎo)致病原菌被分離的機(jī)會降低，大量正常菌群也會抑制病原菌的生長或干擾病原菌的檢出，降低了臨床符合率;再有就是操作程序的不規(guī)范，不重視直接涂片，檢驗過程控制的不嚴(yán)密;且痰液中細(xì)菌的種類很多，它們的生理特性和所需要的培養(yǎng)條件不盡相同。如果要采用培養(yǎng)的方法技術(shù)食品中所有的細(xì)菌種類和數(shù)量，必須采用不同的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，其工作量很大，以上均為導(dǎo)致臨床符合率低的重要原因。
[0006]國內(nèi)外對結(jié)核分枝桿菌的檢測試劑主要基于抗體檢測、核酸檢測和藥敏培養(yǎng)基檢測等。目前，核酸檢測已成為結(jié)核分枝桿菌檢測的主要方法;對結(jié)核分枝桿菌的核酸檢測主要有以下類型:PCR-熒光探針法、環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法、熒光PCR熔解曲線法、PCR-反向點雜交法、DNA微陣列芯片法等。
[0007]由于抗體檢測靈敏度較低、假陽性現(xiàn)象較多，核酸檢測需要熒光PCR儀等大型儀器，且需事先對病原菌進(jìn)行核酸提取、后續(xù)熒光檢測耗時較長等特點，一種儀器應(yīng)用廣泛廉價、操作簡便、結(jié)果判定直觀、靈敏度高的檢測方法呼之欲出。
[0008]焚光原位雜交(FluorescenceIn Situ Hybridizat1n, FISH)是一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，是20世紀(jì)80年代末期發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。FISH的基本原理是用熒光標(biāo)記的單鏈核酸為探針，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸?？捎脽晒鈽?biāo)記的探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而對基因進(jìn)行染色體定位。目前這項技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。
[0009]分子信標(biāo)(molecular beacon)是一種基于焚光共振能量轉(zhuǎn)移原理設(shè)計的一種新型核酸熒光探針，其與靶序列結(jié)合會發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化從而影響熒光信號，因其檢測具有高靈敏性、高特異性，且可用于活體實時檢測，因而被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)等諸多領(lǐng)域。
[0010]在病原菌遺傳信息中，以16SrRNA基因為代表的核糖體RNA基因是病原菌上編碼核糖體RNA(rRNA)相對應(yīng)的DNA序列，存在于所有病原菌的基因組中。該基因具有高度的保守性和特異性以，對以16S rRNA基因為代表的核糖體RNA檢測技術(shù)已成為病原菌檢測和鑒定的一種強(qiáng)有力工具。
[0011]本發(fā)明有效擬合了熒光原位雜交技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)、熒光顯微鏡技術(shù)的優(yōu)點，對痰液樣本中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行直接、簡便、有效的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于:提供一種快速檢測痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌的試劑盒。
[0013]1.本發(fā)明的技術(shù)方案為:提供一種快速檢測痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌的探針、方法和試劑盒。所述探針呈分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)，即探針序列由莖環(huán)結(jié)構(gòu)兩部分組成，總長度25?50個堿基，其中中間的環(huán)序列部分與細(xì)菌中核糖體RNA(16s rRNA,23s rRNA等)序列相匹配，兩端莖部分為5?10個互補(bǔ)的DNA序列，探針的5’-端用熒光基團(tuán)標(biāo)記，3’-端用熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記，在常溫、游離狀態(tài)下探針可自動退火形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)由于距離較近而不發(fā)出熒光信號，只有當(dāng)探針與靶序列成功雜交之后，熒光基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)彼此分離，進(jìn)而發(fā)出熒光信號;所述探針是通過核酸雜交的原理檢測痰液中的結(jié)核分枝桿菌，結(jié)核分枝桿菌分子信標(biāo)探針序列〈SEQ ID N0.1〉為:
5’-TXR-CACGCACGATACGGGCAGACTAGAGTACTGCAGTGCGTG-DABCYL-3’
2.本發(fā)明提供了一種用于檢測痰液中結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括:
(1)權(quán)利要求1所述的探針；
(2)液化液；
(3)裂解液；
(4)終止液；
(5)固定液；
所述液化液包括:l%(w/v)PEG，0.6 mM DTT，13.4 mM NaCl,0.3 mM KCl，I mMNaH2PO4,0.1 mM KH2PO4,50 mM EDTA，0.l%(v/v)TritonX_100，50 mM TrisHCl pH8.0；
所述裂解液包括:5 M鹽酸胍，0.2 mM DTT,50 mM EDTA，0.5%(w/v)過硫酸銨，0.1%(ν/v)TritonX-100,10 mM TrisHCl pH7.0；
所述終止液包括50 mM TrisHCl ρΗΙΟ.Ο,Ο.5 M NaCl ,0.1%(ν/ν) NP-40,0.5%(v/v)Triton X-100；
所述固定液包括:5%(w/v)甘油，0.2 M DTmT, 25 mM NaCl，0.3 mM KCl ,0.6 mMNaH2PO4,0.6 mM KH2PO4,50 mM EDTA，10 mM TrisHCl pH7.0。
[0014]本發(fā)明提供了一種用于檢測痰液樣本中結(jié)核分枝桿菌的方法，所述方法采用上述試劑盒進(jìn)行檢測，所述方法包括以下步驟:
(a)取待檢痰液樣本，加入到液化液中，樣本與所述液化液的體積比為1:1?1:10，震蕩混勻；
(b)取按步驟(a)操作獲得的液體5?10ul滴至載玻片上，50?65°C烘干5?10 min；
(c)將按步驟(b)操作獲得的載玻片浸入乙醇中5?1011^11，50~65°(3烘干5~10 min；
(d)在按步驟(c)操作獲得的載玻片加樣孔中加入探針5?10ul，置于加熱板中50?65°C避光烘干5?10 min；
(e)將按步驟(d)操作獲得的載玻片浸入終止液中卜60sec，置于加熱板中50?65°C烘干5?10 min；
(f)在按步驟(e)操作獲得的載玻片加樣孔中加入固定液5?20ul，加蓋蓋玻片，用熒光顯微鏡鏡檢觀察，用10 X物鏡觀察計數(shù)，用4