一種大麥粒長基因Lkl1的分子標(biāo)記HRM1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及大麥分子育種領(lǐng)域，具體地說，涉及一種大麥粒長基因 Lkll的分子標(biāo) 記HRM1及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大麥?zhǔn)鞘澜缟献罟爬系募Z食作物之一，具有多種用途:集糧食、飼料、啤酒原料以 及醫(yī)藥、保健食品于一身。就其產(chǎn)量而言，大麥?zhǔn)侨虻谖宕筠r(nóng)作物;按其種植面積，是全球 種植和生產(chǎn)的第四大谷類作物有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，目前大麥常年播種面積約有6000萬hm 2,年總 產(chǎn)量約為1.5億噸，僅次于玉米、水稻、小麥。近半個世紀(jì)以來，人類對大麥的生產(chǎn)和需求呈 持續(xù)增長的趨勢。2008年的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，大麥年總需求量為0.274億噸，這在谷類作物中 的需求量僅次于玉米居第二位，因此高產(chǎn)大麥品種的選育一直是育種家關(guān)注的重點。同時， 大麥作為遺傳學(xué)研究的模式植物之一，一直受到遺傳學(xué)家和分子生物學(xué)家的高度重視。分 子標(biāo)記在了解大麥重要經(jīng)濟性狀的遺傳基礎(chǔ)上扮演著重要的角色，分子連鎖圖譜的應(yīng)用為 植物基因組結(jié)構(gòu)分析和比較提供了有力工具。
[0003] 大麥產(chǎn)量性狀是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受多個數(shù)量性狀基因位點（Quantitative trait locus，QTL)控制，具有遺傳力低、受環(huán)境影響大、選擇難度高的特性，所以在選育過 程中，傳統(tǒng)的育種方法存在時間長、消費大、成本高、成果小的問題。分子標(biāo)記輔助育種是一 種采用與特定性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記作為輔助手段進行育種的有效方法，具有不受環(huán)境條 件限制、在植物發(fā)育的整個生長時期均可檢測、選擇效率高等優(yōu)勢。
[0004] 大麥籽粒大小是粒重的重要決定因素，粒長直接影響大麥籽粒大小，而粒重又是 大麥產(chǎn)量的3個構(gòu)成因素之一，因此大麥粒長大小是影響產(chǎn)量的重要因素。因此，闡述大麥 籽粒長的大小的遺傳基礎(chǔ)和分子機制有利于同時改良大麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。
[0005] 大麥籽粒大小遺傳研究總體進展相對緩慢，現(xiàn)階段國內(nèi)外工作主要圍繞籽?；?QTL的分子標(biāo)記定位及其遺傳效應(yīng)開展。最早Kjaer、G.Backes等在1995年將大麥粒長基因 定位在了不同染色體上，近年來又陸續(xù)有研究對大麥粒長位點做了定位研究，如Cassandra K在2013年將大麥控制粒長的位點定位在了除了4H以外的6條染色體上。迄今為止，已報道 的粒長相關(guān)基因 QTL位于7條染色體上，而未見報道對相關(guān)位點做更加深入的研究以完成精 細(xì)定位工作。
[0006] 野生大麥AWCS276相對于大麥品種Baudin具有粒長大，粒寬小，有良好的抗病抗逆 性等特性(陳光登.大麥抗鐮刀菌型莖基腐病遺傳及其與重要農(nóng)藝性狀間關(guān)系[D].四川農(nóng) 業(yè)大學(xué)，2013.)。同時，大麥品種Fleet的粒長也小于野生大麥AWCS276。因此，利用野生大麥 AWCS276和Fleet構(gòu)建遺傳研究群體，進一步驗證野生大麥AWCS276的粒長特性，定位控制粒 長基因，尋找緊密連鎖的分子標(biāo)記，促進大麥粒長基因的圖位克隆，同時為大麥粒長材料的 創(chuàng)制及高產(chǎn)量育種提供新基因資源，進一步利用分子標(biāo)記輔助選擇，將增強粒長預(yù)測的準(zhǔn) 確性，提尚尚廣育種效率，加速實現(xiàn)增加大麥單廣的目標(biāo)。
[0007] 分子標(biāo)記輔助選擇，不依賴于表現(xiàn)型選擇，即不受環(huán)境條件、基因間互作、基因型 與環(huán)境互作等多種因素的影響，而是直接對基因型進行選擇，因而能大大提高育種效率。高 分辨熔解曲線（High Resolution Melting，HRM)技術(shù)近年來國際上興起的一種SNP及突變 研究工具。這種檢測方法具有操作簡便、特異性好、高通量、快速、檢測成本低、結(jié)果準(zhǔn)確等 優(yōu)勢，并且實現(xiàn)了真正的閉管操作而受到普遍的關(guān)注。因此，篩選出與粒長基因緊密連鎖 的，且適用于熒光定量PCR平臺HRM技術(shù)的分子標(biāo)記，不僅能對大麥粒長基因進行選擇，有效 調(diào)控大麥籽粒長短，同時提高了選擇通量、速度和準(zhǔn)確性，解決了大規(guī)模推廣應(yīng)用的技術(shù)瓶 頸，對規(guī)模化改良大麥育種群體質(zhì)量和產(chǎn)量具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供與大麥粒長基因 Lkll緊密連鎖的分子標(biāo)記。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述分子標(biāo)記的熒光定量PCR引物。
[0010] 本發(fā)明的第三個目的在于提供上述大麥粒長基因 Lkll緊密連鎖的分子標(biāo)記的應(yīng) 用。
[0011] 本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0012] 本發(fā)明的新粒長基因 Lkll來自野生大麥AWCS276,該基因位于大麥3H染色體。Lkll 能顯著提高大麥粒長，L0D值大于5.07，解釋約29.1 %的表型變異。
[0013]本發(fā)明所提供的分子標(biāo)記HRM1的核苷酸序列如SEQ ID No.l所示。
[0014] 本發(fā)明所述分子標(biāo)記與大麥粒長基因 Lkll共定位于大麥3H染色體，且與Lkll之間 的遺傳距離為〇. lcM。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種鑒定大麥粒長基因 Lkll的分子標(biāo)記的方法，以待測植株樣品 的基因組DNA作為模板，用熒光定量PCR引物進行熒光定量PCR擴增，利用擴增結(jié)果進行基因 型分型，將與AWCS276分為同一類型的植株鑒定為含有大麥粒長基因 Lkll的植株。
[0016] 可選的，所述方法包括以下步驟：
[0017 ] (1)以待測植株樣品的基因組DNA作為模板，用熒光定量PCR引物進行熒光定量PCR 擴增：
[0018] (2)熒光定量PCR擴增反應(yīng)體系：SsoFast EvaGreen超混合液5yL、上游引物和下游 引物各300ng、模板0嫩100即、0仙68/1?他86-;^66去離子水加至總量為1(^1^;
[0019] (3)熒光定量PCR程序:95°C預(yù)變性5min; 94°C變性15s、53°C退火30s，共50個循環(huán)； 熔解曲線范圍為65~95°C，每0.2°C讀一次數(shù)，時間為10s;
[0020] (4)利用步驟(3)獲得的結(jié)果進行基因分型。
[00211其中，所述待鑒定植株的DNA取自大麥樣品三葉期的葉片。
[0022]本發(fā)明還提供了所述分子標(biāo)記的熒光定量PCR引物，其中，上游引物序列如SEQ ID No.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示。
[0023] 本發(fā)明還提供了所述分子標(biāo)記HRM1在大麥育種中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明還提供了所述分子標(biāo)記HRM1在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，其中，所述基因 為粒長基因 Lkll。
[0025] 本發(fā)明還提供了本分發(fā)明所述方法在大麥育種改良中的應(yīng)用。
[0026] 本方還提供了所述的熒光定量PCR引物在分子標(biāo)記輔助大麥高產(chǎn)育種中的應(yīng)用。
[0027] 在本發(fā)明中，大麥粒長基因 Lkll及分子標(biāo)記HRM1是通過以下方法獲得的：
[0028] (1)利用長粒長野生大麥AWCS276作為母本，以大麥Baudin為父本雜交，得到雜種 F1，F(xiàn)1代單株自交獲得F2,采用單粒傳法獲得含有130個株系的F8代RIL群體，構(gòu)成遺傳作圖 群體。
[0029] (2)用CTAB法提取所述的遺傳作圖群體的各株系的DNA，用DArT芯片技術(shù)，以親本 AWCS276和Baudin的DNA為模版，進行基因分型，獲得所述RIL群體的基因型資料。親本 AWCS276的帶型記為A，親本Baudin的帶型記為IF8群體株系帶型來源于AWCS276的記為A， 來源于Baudin的記為B。
[0030] (3)大麥完熟期所述F8群體室內(nèi)考種鑒定籽粒的粒長。
[0031 ] (4)利用JoinMap4.0作圖軟件將獲得的所述RIL群體基因型資料構(gòu)建大麥分子連 鎖圖譜，尋找最優(yōu)的標(biāo)記數(shù)和標(biāo)記順序，確定后續(xù)使用的連鎖群。利用軟件MapQTL 6.0的區(qū) 間作圖模型（Interval Mapping)，并結(jié)合F8群體粒長表型數(shù)據(jù)將粒長基因 Lkll定位于3H染 色體上一個〇.4cM的區(qū)段內(nèi)。
[0032] (5)獲取該區(qū)段內(nèi)的DArT探針序列，通過在大麥Morex的基因組測序數(shù)據(jù)，獲得目 標(biāo)區(qū)段更多的序列信息，電子延長DArT探針序列兩端對應(yīng)的序列，并進行序列分析，初步篩 選用于后續(xù)熒光定量PCR引物設(shè)計的目標(biāo)區(qū)域。
[0033] (6)設(shè)計熒光定量PCR引物，用于后續(xù)篩選。利用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計熒 光定量PCR引物10對(見表1)。熒光定量PCR引物設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)：引物長度18~25bp，擴增產(chǎn)物長 度65~100bp，退火溫度60°C，GC含量在40 %~60 %之間，SNP差異位點產(chǎn)物退火溫度差異大 于0.2°C。
[0034] 表1 10對HRM引物序列及擴增片段長度
[0035]
[0037] (7)高分辨熔解曲線(HRM)分析
[0038] a)親本之間多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選:選取上述設(shè)計的10對引物，以親本AWCS276和 Baudin的DNA為模版，進行PCR擴增，共獲得1對效果良好的熒光定量PCR分子標(biāo)記引物，命名 為HRM1-F/R(核苷酸序列如SEQ ID -.2和3所示）。擴增產(chǎn)物為具有多肽性的分子標(biāo)記 HRM1，核苷酸序列如SEQ ID No.l所示
[0039] b)F8群體的HRM分析：用上述步驟獲得的具有多態(tài)性的分子標(biāo)記HRM1的PCR引物， 擴增親本AWCS276、Baudin和F8群體植株的DNA，進行基因型鑒定，獲得分子標(biāo)記數(shù)據(jù)。親本 AWCS276的類型記為A，擴增片段大小長92bp，單堿基差異位點為C。親本Baudin的類型記為 B，擴增片段長92bp，單堿基差異位點為IF8群體株系類型來源于AWCS276的記為A，來源于 Baudin的記為B。
[0040] 有益效果：
[0041 ]本發(fā)明首次公開了來自大麥AWCS276的粒長基因 Lkll，位于大麥3H染色體，顯著增 加大麥粒長。該基因在大麥產(chǎn)量(調(diào)控粒重)育種中具有較高的利用價值。
[0042] 本發(fā)明首次公開了基于熒光定量PCR平臺精確檢測大麥AWCS276新粒長基因 Lkll 的分子標(biāo)記HRM1，且為共顯性標(biāo)記，檢測準(zhǔn)確高效、擴增方便穩(wěn)定。
[0043] 本發(fā)明公開的分子標(biāo)記HRM1與粒長基因 Lkll極顯著相關(guān)，呈現(xiàn)共分離標(biāo)記特征， 用于分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性高，提高適應(yīng)不同環(huán)境的大麥長粒長品種的選擇鑒定效 率，且成功率高。
【附圖說明】
[0044]圖1為大麥AWCS276長粒長基因 Lkll在3H染色體上的位置及與本發(fā)明分子標(biāo)記 HRM1之間的連鎖遺傳圖譜。
[0045] 圖2為AWCS276XBaudin的F7RIL群體后代用熒光定量PCR引物做基因型分型的結(jié) 果。
[0046]圖3為AWCS276XFleet的F7RIL群體后代用熒光定量PCR引物做基因型分型的結(jié) 果。
【具體實施方式】
[0047]下面將通過【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實施例的給 出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在 不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。
[0048] 實