一種莖環(huán)結(jié)構(gòu)組合探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的組合探針，以及該 組合探針在端粒酶活性檢測及RNA和DNA定量檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 端粒酶(Telomerase)是一種使端粒延伸的反轉(zhuǎn)錄DNA合成酶，是由RNA和蛋白質(zhì)組 成的核糖核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物。端粒酶彌補了因每次細(xì)胞分裂而逐漸縮短的端粒長度。但是 端粒酶的活性在正常體細(xì)胞中受到相當(dāng)嚴(yán)密的調(diào)控，所以端粒酶活性在正常的人體細(xì)胞中 受到抑制，但在腫瘤細(xì)胞中被激活，與癌細(xì)胞的不斷增殖密切相關(guān)。所以檢測端粒酶的活 性，可以實現(xiàn)對癌癥的診斷，同時以端粒酶為靶標(biāo)分子，研究有效的端粒酶活性抑制劑，對 開發(fā)抗癌藥物具有重要意義。傳統(tǒng)的檢測端粒酶的方法主要是基于PCR擴增技術(shù)的端粒重 復(fù)放大的方法（Telomeric Repeat Amplification protocol，TRAP)。該方法在經(jīng)過 PCR 擴 增后進行電泳分離和檢測，可以檢測到幾個癌細(xì)胞中端粒酶的活性，但是操作比較繁瑣，而 且電泳分析不能達(dá)到定量分析的結(jié)果。更為重要的是在篩選端粒酶活性抑制劑實驗過程 中，這些抑制劑也可能抑制PCR擴增反應(yīng)中DNA聚合酶的活性，所以TRAP方法不適于端粒酶 抑制劑的篩選檢測。隨后發(fā)展起來的端粒酶檢測方法是放射性同位素標(biāo)記后的成像分析， 該方法存在放射性污染，對人體和環(huán)境有一定的危害，由此大大增加了操作的復(fù)雜性，限制 了該方法的應(yīng)用。所以人們一直在努力研究建立端粒酶活性檢測方法。如表面等離子體共 振、電化學(xué)分析、量子點熒光共振能量轉(zhuǎn)移、端粒酶誘導(dǎo)生成金屬納米線、具有催化性能的 分子信標(biāo)、PPI生物發(fā)光等。但是這些方法由于缺乏有效的DNA擴增信號放大過程，導(dǎo)致這些 方法的靈敏度都達(dá)不到TRAP的水平。因此，考慮到抗癌藥物篩選工作量大以及檢測成本等 各方面的需要，理想的端粒酶活性檢測方法應(yīng)擺脫放射性污染的缺點，且需滿足檢測快速、 操作簡便、選擇性好、靈敏度高、可靠、普適、經(jīng)濟等特點。
[0003] RNA和DNA是生命體重要的遺傳物質(zhì)，RNA和DNA的表達(dá)水平與癌癥發(fā)展密切相關(guān)， 可以作為癌癥早期診斷的標(biāo)志物，對特定序列RNA和DNA進行準(zhǔn)確、靈敏檢測對于RNA和DNA 生物功能的研究和癌癥早期診斷都具有十分重要的意義。RNA和DNA的分析方法主要為雜交 反應(yīng)的檢測方法。其中Southern印跡雜交方法需要經(jīng)過電泳分離，結(jié)合放射性同位素標(biāo)記 或酶標(biāo)記利用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色實現(xiàn)RNA和DNA的定量分析。該方法存在放射性危 害，對人體造成傷害，且檢測信號無法實時監(jiān)測等弊端，需要復(fù)雜的操作步驟才能實現(xiàn)信號 的讀出。分子信標(biāo)(Molecular Beacon，簡稱MB)探針技術(shù)以發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在，其莖部雙鏈兩端 分別標(biāo)記熒光基團和猝滅基團，無目標(biāo)RNA或DNA存在時，MB以發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在，熒光猝滅。目 標(biāo)RNA或DNA存在時會與MB雜交產(chǎn)生目標(biāo)RNA或DNA的特異性熒光信號，該分子信標(biāo)檢測方法 已經(jīng)獲得了廣泛應(yīng)用。但需要指出的是該方法缺乏信號放大機制，使得檢測靈敏度受到了 很大的限制，并且分子信標(biāo)需要雙標(biāo)記，價格昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有端粒酶活性檢測及RNA和DNA定量檢測存 在的問題，提供一種成本低廉、靈敏度高、選擇性好的莖環(huán)結(jié)構(gòu)組合探針，以及該組合探針 在端粒酶活性檢測及RNA和DNA定量檢測中的應(yīng)用。
[0005] 解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:該組合探針由兩個具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA 序列組成，其中探針I(yè)和探針I(yè)I從5'端到3'端依次為莖環(huán)區(qū)、檢測物識別區(qū)，所述的檢測物 為端粒酶、RNA或DNA，探針I(yè)和探針I(yè)I的莖環(huán)區(qū)的堿基序列相同或不同，其中當(dāng)檢測物為端 粒酶時，所述探針I(yè)的檢測物識別區(qū)是端粒酶底物序列，探針I(yè)I的檢測物識別區(qū)是與端粒酶 延伸序列中8~40個堿基互補的序列；當(dāng)檢測物為RNA或DNA時，所述探針I(yè)的檢測物識別區(qū) 是與待測RNA或DNA的鄰近3'端8~40個堿基互補的序列，探針I(yè)I的檢測物識別區(qū)是與待測 RNA或DNA的鄰近5'端8~40個堿基相同的序列。
[0006 ]上述的莖環(huán)區(qū)的莖的長度優(yōu)選為5~18個配對的堿基序列，莖環(huán)區(qū)的環(huán)的長度優(yōu) 選為15~35個堿基序列。
[0007] 上述的檢測物為端粒酶時，探針I(yè)的檢測物識別區(qū)是端粒酶底物序列，優(yōu)選探針I(yè)I 的檢測物識別區(qū)是與端粒酶延伸序列中15~25個堿基互補的序列。
[0008] 上述的檢測物為RNA或DNA時，優(yōu)選探針I(yè)的檢測物識別區(qū)是與待測RNA或DNA的鄰 近3'端15~25個堿基互補的序列，優(yōu)選探針I(yè)I的檢測物識別區(qū)是與待測RNA或DNA的鄰近5' 端15~25個堿基相同的序列。
[0009] 本發(fā)明莖環(huán)結(jié)構(gòu)組合探針在檢測端粒酶活性中的應(yīng)用，具體檢測方法為:將檢測 物識別區(qū)為端粒酶底物序列的探針I(yè)加入待測端粒酶中進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)完后加入檢 測物識別區(qū)是與端粒酶延伸序列中8~40個堿基互補的序列的探針I(yè)I，在Bst DNA聚合酶的 作用下進行環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴增反應(yīng)，并加入SYBR Green I熒光染料，實時檢測熒光信 號，根據(jù)實時熒光曲線的最大拐點所對應(yīng)的時間即可確定端粒酶的活性高低，時間越長說 明端粒酶活性越低，時間越短說明端粒酶活性越高。
[0010] 本發(fā)明莖環(huán)結(jié)構(gòu)組合探針在定量檢測RNA或DNA中的應(yīng)用，具體檢測方法為:將檢 測物識別區(qū)是與待測RNA或DNA的鄰近3'端8~40個堿基互補的序列的探針I(yè)加入不同濃度 的待測RNA或DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品中，并加入頂替引物A，在BstDNA聚合酶的作用下進行延伸頂替反 應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后加入檢測物識別區(qū)是與RNA或DNA的鄰近5'端8~40個堿基相同的序列的探 針I(yè)I和頂替引物B，進行延伸頂替反應(yīng)和環(huán)介導(dǎo)的等溫核酸擴增反應(yīng)，并加入SYBR Green I 熒光染料，實時檢測熒光信號，繪制濃度與實時熒光強度的最大拐點對應(yīng)時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線； 按照上述方法測試待測RNA或DNA樣品的實時熒光強度最大拐點對應(yīng)的時間，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線 即可確定待測樣品中RNA或DNA的含量。
[0011] 上述的頂替引物A是與待測RNA或DNA中5~30個堿基互補的序列，且該5~30個堿 基與待測RNA或DNA中與探針I(yè)檢測識別區(qū)互補部分的3'端鄰近;所述的頂替引物B是與待測 RNA或DNA中5~30個堿基相同的序列，且該5~30個堿基與待測RNA或DNA中與探針I(yè)I檢測識 別區(qū)相同部分的5'端鄰近。
[0012] 本發(fā)明莖環(huán)結(jié)構(gòu)組合探針在端粒酶抑制劑篩選中的應(yīng)用，具體方法與端粒酶活性 檢測方法相同，只需在制備端粒酶延伸產(chǎn)物時加入端粒酶抑制劑。
[0013] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0014] 1、本發(fā)明組合探針不需要熒光標(biāo)記和放射性元素標(biāo)記，該探針特有的頸環(huán)結(jié)構(gòu)為 下一步核酸擴增反應(yīng)提供了特異性的擴增模板，克服了傳統(tǒng)放射性標(biāo)記存在的放射性危害 和大多數(shù)核酸擴增反應(yīng)中非特異性擴增的發(fā)生。
[0015] 2、本發(fā)明組合探針用于端粒酶活性分析操作極為簡便，只需將癌細(xì)胞經(jīng)過裂解就 可以得到含有端粒酶的細(xì)胞裂解液，直接用于端粒酶底物的反轉(zhuǎn)錄延伸反應(yīng)，不需要復(fù)雜 的分離提純過程，大大提高了該方法操作的簡便性，在普通的生物實驗室即可完成，克服了 現(xiàn)有端粒酶活性檢測方法步驟繁瑣、成本較高、靈敏度低和選擇性低等缺點，可以有效地檢 測到單個癌細(xì)胞中端粒酶的活性，應(yīng)用前景廣闊。
[0016] 3、本發(fā)明組合探針可通過實時熒光分析法進行端粒酶活性檢測，而熒光分析方法 非常適用于與一些自動化儀器相結(jié)合進行高通量檢測，因此在高通量端粒酶抑制劑的篩選 中也展現(xiàn)出了巨大的應(yīng)用潛力。
[0017] 4、本發(fā)明組合探針對癌細(xì)胞中RNA和DNA也可以進行良好的定量檢測，克服了升降 溫過程耗時的缺點，實現(xiàn)了恒溫條件下的信號快速放大，具有高的靈敏度和擴增效率。
[0018] 5、本發(fā)明組合探針還可通過終點熒光檢測、共振光散射檢測、凝膠電泳檢測等分 析方法進行端粒酶活性及RNA和DNA的定量檢測。
【附圖說明】
[0019] 圖1是實施例1中莖環(huán)結(jié)構(gòu)組合探針檢測端粒酶的原理示意圖。
[0020] 圖2是熒光強度隨著端粒酶濃度變化的實時熒光曲線圖。
[0021 ]圖3是不同濃度抑制劑對端粒酶活性抑制的實時熒光曲線圖。
[0022] 圖4是實施例2中莖環(huán)結(jié)構(gòu)組合探針檢測mRNA的原理示意圖。
[0023] 圖5是熒光強度隨著mRNA濃度變化的實時熒光曲線圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護范圍不僅限于 這些實施例。
[0025] 實施例1
[0026] 針對端粒酶底物序列5' -AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'，設(shè)計合成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針 I 和探針 I I ， 探針 I 的堿基序列為 5 '- CGACAGCAGAGGATTTGTTGTGTGGAAGTGTGAGCGGATTTTCCTCTGCTGTCGTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3 '(由寶生物工程（大連）有限公司提供）；探針I(yè) I的堿基序列為5 '-ATCGTCGTGACTGTTTGTAATAGGACAGAGCCCCGCACTTCAGTCACGACGATTTTCCCTAACCCTAACCCTAACCC -3'(由寶生物工程(大連)有限公司提供）。
[0027] 采用上述探針I(yè)和探針I(yè)I檢測宮頸癌細(xì)胞(Hela)中的端粒酶活性，具體方法如下： [0028]將培養(yǎng)的他1&細(xì)胞從培養(yǎng)基中消化離心分離，用冷的0^^5緩沖溶液（1〇111111〇1/1磷 酸鹽，O.lmol/L NaCl，pH 7.4)洗滌離心3次，然后以2000轉(zhuǎn)/分離心511^11。洗滌后的細(xì)胞加 入冷的D-PBS緩沖溶液中，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為lOOcell/yL。分別向100個(3組）、10個(5組)和1 個（10組)Hela細(xì)胞中加入lyL預(yù)冷的CHAPS細(xì)胞裂解緩沖溶液，在冰上放置30分鐘，得到不 同濃度的Hela細(xì)胞裂解液，其中10個Hela細(xì)胞和1個Hela細(xì)胞是利用顯微操作系統(tǒng)取出。 [0029]在200yL離心管中分別加入1.8yL水、0.5yL端粒酶反轉(zhuǎn)錄延伸反應(yīng)緩沖溶液 (200mmol/L Tris-HCl，15mmol/L MgCl2,630mmol/L KCl，10mmol/L EGTA，0.5%吐溫-20， pH=8.3，25°C)、1.OyL 2.5mmol/L脫氧核苷三磷酸(dNTP)水溶液、0.5yL 2ymol/L探針I(yè)水 溶液、〇.2yL 40u