一種乙型肝炎病毒hbv實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒的生物醫(yī)學檢測技術領域，具體涉及將特異性靶標捕獲技術和實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術結合的乙型肝炎病毒(HBV)的核酸恒溫擴增檢測中使用的引物、探針及相關試劑盒。
【背景技術】
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題。全球每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌(肝癌)，肝癌患者中，75%以上由HBV所致。
[0003]我國屬HBV感染地方性流行區(qū)。根據2006年全國乙型肝炎流行病學調查，我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例，每年因HBV導致的肝硬化和肝癌死亡約30余萬例，新發(fā)乙型肝炎病例約50?100萬例。乙肝防治是當前及今后相當長時間內要面臨的重要任務。
[0004]HBV已發(fā)現(xiàn)有9個基因型(A?I)，每個基因型又可分為不同亞型，且存在基因型之間的重組現(xiàn)象。我國已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D基因型，中東部地區(qū)以B、C基因型占優(yōu)勢，其中北方地區(qū)(長江以北)主要為C2亞型；南方大部分地區(qū)流行株為B2、C2、Cl亞型，并有少部分D基因型；西部地區(qū)尤其是新疆地區(qū)以D基因型為主，西部藏族居民中以C/D重組基因型為主；A型和BI亞型罕見。
[0005]乙型肝炎病毒的主要檢測方法有:血清學檢查、生化學檢查及分子生物學法。病毒分離培養(yǎng)和血清學方法，繁雜費時，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需要。PCR法需要經歷幾十個溫度變化的循環(huán)過程，擴增反應時間長，且產物為DNA，易污染。
[0006]核酸檢測主要涉及核酸提取與和核酸擴增檢測。
[0007]目前血清和血漿中病毒核酸的提取方法主要有煮沸裂解法、離心柱提取法及磁珠法。煮沸裂解法不能有效去除抑制成分，且易于污染；柱提取法操作過程復雜，效率低，且不易于實現(xiàn)自動化；磁珠法能快速實現(xiàn)核酸的分離與純化，易于實現(xiàn)自動化操作。
[0008]國內已有多種基于實時熒光PCR技術檢測HBV-DNA的試劑盒應用于實際檢測中，這些試劑盒所提供的HBV-DNA提取方法主要是煮沸法，但是，有很多不足之處:1)特異性不是很好，不能檢測出所有HBV的九個基因型(A-1) ; 2)核酸提取過程較復雜，樣本處理耗時長，且在處理樣本時，經過煮沸裂解、高速離心富集DNA等多個步驟，樣本中的DNA存在損耗，尤其對于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會造成DNA的大量丟失，同時由于采用了水浴或金屬浴的高溫加熱步驟，容易造成氣溶膠污染。3)檢測靈敏度低，大部分約在500IU/ml左右；
實時突光核酸恒溫擴增檢測技術(Simultaneous Amplificat1n and Testing,簡稱SAT)是一種直接針對核酸(DNA和RNA)快速擴增RNA并檢測的方法，與檢測DNA的實時熒光PCR相比，不同之處，前者檢測體系多了一個逆轉錄反應的步驟，核酸擴增在一個溫度下進行(42°C )，無需熱循環(huán)。采用M-MLV逆轉錄酶和T7 RNA聚合酶進行核酸擴增，相對于其它核酸擴增技術，反應抑制物更少，能有效減少假陰性結果。然而，SAT技術在不同種類病毒的檢測中應用所面臨的問題各不相同，需要具體分析病毒的特性結合實際樣本溶液基質進行專門、針對性地設計。目前尚無針乙型肝炎病毒DNA進行實時熒光恒溫擴增檢測的試劑盒，進一步，能同時對乙型肝炎病毒DNA和RNA的提取、并擴增的核酸恒溫擴增檢測產品也未見報道。

【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種快速，高準確度，污染易控，設備簡單，成本低的乙型肝炎病毒DNA檢測試劑盒，同時進一步提供可實現(xiàn)HBV DNA和RNA同步擴增檢測的產品。此夕卜，本試劑盒也解決了現(xiàn)有技術中的乙型肝炎檢測試劑盒特異性及敏感性不好，不能檢測出所有HBV A-1九個基因型的技術問題。
[0010]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn):
一種乙型肝炎病毒HBV實時熒光恒溫擴增檢測試劑盒，包含有一條乙型肝炎病毒的靶標核酸的捕獲探針，一對用于靶標核酸擴增的引物T7和nT7，和一條用于與所述靶標核酸擴增產生的RNA拷貝特異結合的檢測探針；所述檢測引物由Τ7引物和ηΤ7引物組成，Τ7引物序列如序列表中序列I所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列2所示；所述檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列3所示，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團。
[0011]所述試劑盒包含的捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
[0012]所述試劑盒包含的捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
[0013]進一步，所述的試劑盒所包含的捕獲探針為序列表中序列4與序列5的混合物，按1:1?6:1比例(v/v)混合組成。
[0014]此外，所述試劑盒還包含有M-MLV反轉錄酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反轉錄酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕獲探針存在于病毒核酸提取液中，所述T7弓丨物、nT7引物和檢測探針存在于擴增檢測液中。
[0015]進一步，所述試劑盒還包含有HBV內標和內標檢測探針，可以有效監(jiān)控假陰性的存在；所述HBV內標為乙型肝炎病毒核苷酸序列的競爭性內標，可與捕獲探針特異性結合，并使用Τ7和ηΤ7引物，由序列表中序列6所示的體外轉錄RNA ;所述內標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端標記HEX熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團，且所述內標檢測探針存在于擴增檢測液中。
[0016]再進一步，所述試劑盒包含病毒核酸提取液、洗滌液1、洗滌液2、HBV擴增檢測液、SAT酶液、HBV陽性對照、HBV陰性對照、HBV內標和稀釋液，其中:
病毒核酸提取液:含捕獲探針和磁珠；
洗滌液1:含NaCl和SDS ；
洗滌液2:礦物油；
HBV擴增檢測液:含dNTP、ΝΤΡ、Τ7引物、ηΤ7引物、HBV檢測探針和內標檢測探針；
SAT酶液:含M-MLV反轉錄酶、Τ7 RNA聚合酶；
HBV陽性對照；含乙型肝炎病毒表面抗原基因核酸的稀釋液或乙型肝炎病毒體外轉錄RNA的稀釋物；
HBV陰性對照:不含有乙型肝炎病毒靶標核酸序列或不含有乙型肝炎病毒的血清或血漿溶液；
HBV內標:HBV IC RNA稀釋物；
稀釋液:含硫酸銨(NH4) #04和HEPES。
[0017]再進一步，所述的試劑盒中一個反應單位中各種試劑組成如下:
Cl)病毒核酸提取液:HEPES 250-800mM, LLS 4-10%,捕獲探針1_50 μ M，磁珠50_500mg/L ；
(2)洗滌液1:HEPES 5-50mM, NaCl 50-500 mM, 1% SDS，EDTA 1-1OmM ；
(3)洗滌液2:礦物油；
(4)HBV 擴增檢測液:Tris 10-50mM, MgC12 10_40mM，dNTP 0.1-1OmM, NTP l_20mM，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM，HBV引物和探針濃度在2.5-10pmol/反應；進一步，T7引物優(yōu)選濃度為2.5pmol/反應，nT7引物優(yōu)選濃度為2.5pmol/反應，HBV檢測探針優(yōu)選濃度為5pmol/反應，內標檢測探針優(yōu)選濃度為5pmol/反應；
(5)SAT酶液:M-MLV反轉錄酶400-4000U/反應、T7 RNA聚合酶200-2000U/反應、2-1OmM HEPES ρΗ7.5、10-100 mM N-acetyl-L-cysteine>0.04-0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose,40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA,0.1-1% (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；
(6)HBV陽性對照；含15-1O8拷貝/mL的乙型肝炎病毒表面抗原基因核酸的稀釋物或乙型肝炎病毒體外轉錄RNA的稀釋物；
(7)HBV陰性對照:不含有乙型肝炎病毒靶標核酸序列或不含有乙型肝炎病毒的血清或血漿溶液；
(8)HBV內標:含14-1O8拷貝/mL HBV IC RNA的稀釋物；
(9)稀釋液:25-250mMHEPES，5_50mM (NH4)2S04。
[0018]所述乙型肝炎病毒HBV核酸恒溫擴增檢測試劑盒中的專用試劑，為以下表示的物質之一:
(1)用于擴增HBV靶標核酸的HBV檢測引物T7和nT7，Τ7引物序列如序列表中序列I所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列2所示；
(2)用于與在Τ7RNA聚合酶作用下HBV靶標核酸擴增產生的RNA拷貝特異結合的HBV檢測探針，所述HBV檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列3所示，5’端標記FAM熒光基團，3’端標記DABCYL淬滅基團；
(3)用于與HBV核苷酸成競爭性的內標核苷酸擴增產生的RNA拷貝特異結合的HBV內標檢測探針，所述內標檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列7所示,5’端標記HEX突光基團，3 ’端標記DABCYL淬滅基團。
[0019]本發(fā)明提供了一種乙型肝炎病毒的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，使用該試劑盒進行檢測，與現(xiàn)有HBV檢測相比，具有以下優(yōu)點:
(I)本發(fā)明試劑盒針對HBV A-1 9個基因型進行靶標篩選、引物設計，涵蓋范圍廣，具有高準確度、高特異性，可以實現(xiàn)對血清、血漿等樣本中的乙型肝炎病毒進行快速、準確測定。
[0020](2 )本發(fā)明試劑盒針對血清、血漿基質特點，對不同周期產生的HBV DNA和RNA進行了提取優(yōu)化，設計了針對性的捕獲探針及提取體系，一方面避免了現(xiàn)有技術中提取DNA的加熱、離心等操作，簡化實驗步驟，易于實現(xiàn)自動化，對檢測靈敏度有了較大提高；另一方面，實現(xiàn)了同步提取HBV的DNA和RNA的操作。
[0021](3)本發(fā)明試劑盒中加入內標，可進一步有效監(jiān)控假陰性的存在，提供更準確的檢測結果。
[0022](4)本發(fā)明將核酸的擴增與檢測在同一封閉體系中同步進行，整個過程沒有升溫、降溫過程，大大縮短了擴增及檢測時間；同時降低了對所用PCR儀的設計和生產成本。
[0023](5)本發(fā)明擴增產物為RNA，RNA在自然界中極易降解，相對PCR擴增DNA而言，污染易控，交叉影響小。
[0024]應理解，在本發(fā)明范圍內中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附圖說明】
[0025]圖1比對組的引物對和探針序列的熒光檢測結果；
圖2本發(fā)明組的引物對和探針序列的熒光檢測結果