一種快速鑒別新城疫強毒株的逆轉錄熒光定量pcr引物及鑒別方法
【技術領域】
[0001]
本發(fā)明涉及分子生物學和分子病毒學領域的病毒檢測技術，特別涉及一種快速鑒別新城疫強毒株的逆轉錄熒光定量PCR引物，還涉及使用所述引物的鑒別方法。
【背景技術】
[0002]
新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus)引起的一種急性、高度接觸性禽類傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的法定報告疫病，給許多國家的養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。NDV又稱禽副黏病毒I型，在分類上屬于單鏈負股病毒目、副黏病毒科、副黏病毒亞科的禽腮腺炎病毒屬。NDV基因組包含6個開放閱讀框，從5 ’到3 ’依次編碼L-HN-F-M-P-NP 6種結構蛋白，其中F蛋白是最主要的糖蛋白之一，病毒毒力的強弱與其裂解位點區(qū)的氨基酸序列相關，強毒株氨基酸序列一般為mR/K-R-Q_K/R-R-Fm，而弱毒株則改變?yōu)閙G/E-K/R-Q-G/E-R-Lm，氨基酸序列的變化導致了NDV FO蛋白不易被裂解，從而降低了病毒囊膜與宿主細胞膜的融合活性，使病毒感染性降低或者無感染性，這也是在基因水平上區(qū)分NDV強、弱毒株的把點，因此，可以以此進行NDV強弱毒株的區(qū)分。
[0003]目前，我國對于新城疫的防控依賴于疫苗，有效的疫苗和合理的免疫程序很大程度上控制了該病的爆發(fā)和流行。但由于我國養(yǎng)殖環(huán)境復雜，標準化、規(guī)?；B(yǎng)殖水平不足，致使新城疫疫情時有發(fā)生，并常以非典型病癥呈現(xiàn)，所以必須經(jīng)實驗室診斷進行病例的確診和病毒的分離、鑒定。NDV檢測主要使用PCR技術和血清學技術，而分離鑒定則主要采用雞胚接種傳代方法。然而，由于疫苗(滅活疫苗和弱毒苗)的廣泛使用和一些天然弱毒株的存在，從免疫雞群中檢測到的NDV可能是被接種的疫苗病毒或者是不至于引起發(fā)病的弱毒株，所以即使檢測和分離到了NDV，也不能確定雞群感染了野毒，發(fā)生了新城疫疫情。所以，準確掌握NDV的感染情況，首先要排除疫苗毒的干擾。建立快速、準確區(qū)分NDV強、弱毒株的方法，可以第一時間確定是否發(fā)生了新城疫疫情，以便有效控制危害性大的NDV強毒對雞群的感染。
[0004]黃淑堅等(養(yǎng)禽與禽病防治，2009，4:18-21)設計了兩對特異性引物建立了區(qū)分NDV強、弱毒的PCR方法(檢測敏感性為10pg，換算成拷貝數(shù)大概為15拷貝)；岳華等(中國獸醫(yī)學報，2007，27(3): 300-304)建立了基于TaqMan探針的檢測中、強毒力新城疫病毒RNA的熒光定量方法(TaqMan探針造價高，檢測敏感性為60拷貝)，但前者在操作的簡便性和靈敏度方面有所欠缺，后者則在檢測成本和靈敏度方面有提升空間。公開號為CN101153343A的中國發(fā)明專利申請，公開了一種特異檢測強毒型和中毒型雞新城疫病毒的熒光定量PCR引物及方法，來鑒別強毒型和中毒型雞新城疫病毒，但靈敏度方面依然不夠理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]
為了解決以上鑒別強弱毒雞新城疫病毒技術中存在的成本高、敏感性差的問題，本發(fā)明提供了一種快速、靈敏、低成本的區(qū)分NDV強弱毒株的方法。本發(fā)明基于NDV強、弱毒基因序列的分析，通過特異性引物的設計，建立標準曲線，最終構建了基于SYBR Green I嵌合熒光的鑒別NDV強毒的逆轉錄焚光定量PCR(reverse transcript1n fluorescencequantitative PCR，RT_qPCR)方法。
[0006]本發(fā)明是通過以下步驟得到的:
本發(fā)明所述的特異性引物的設計，是根據(jù)GenBank中登錄的所有NDV F基因序列，篩選與強弱毒裂解位點關聯(lián)一致的序列，然后根據(jù)強毒的序列特征設計一對特異性引物，從而達到只擴增強毒而不擴增弱毒的目的。引物序列如下:
NDV F realtime-1:5’- AGGACGGAGACARAARCGCT -3’
NDV F realtime-2: 5’- AGTCGGAGGATGTTGGCAGC -3’
擴增產(chǎn)物長度為131bp。另設計合成了含T7啟動子的上游序列NDV F realtime-T7-l:5’- TAATACGACTCACTATAGGG AGGACGGAGACARAARCGCT _3’，用于體外轉錄模板的制備。
[0007]本發(fā)明所述的鑒別NDV強毒的RT-qPCR方法的建立，首先需要進行強毒NDV RNA的提取和體外轉錄模板的制備。經(jīng)TRizol法提取強毒株NDV的RNA，以提取的RNA為模板，以NDV F realtime-T7-l、NDV F realtime-2為引物經(jīng)一步法RT-PCR擴增得到的目的條帶作為體外轉錄模板。優(yōu)選的一步法RT-PCR反應體系為:PrimeScript I step enzyme mix 2yL，2*l step buffer 25yL，NDV F realtime-T7_l引物lOOpmol/yL lyL，NDV F realtime-2引物10pmolAiL IyL，RNA模板2yL，RNase free水補足50yL。優(yōu)選的一步法RT-PCR反應條件為:50°C 反轉錄30 min; 95°C 預變性2 min; 94°C變性I min, 53°C退火30 s, 72°C延伸I min,共32個循環(huán)；72°C延伸10 min。
[0008]其次進行RNA標準品的合成，取IyL體外轉錄模板進行T7RNA聚合酶進行體外轉錄，按體外轉錄試劑盒說明書(T7 RNA Polymerase, TaKaRa)進行操作，產(chǎn)物最終溶解于DEPC水中，并用紫外分光光度計測其濃度。通過公式將得到的RNA換算為拷貝數(shù)，并用RNase Free Water進行10倍倍比稀釋，將稀釋的RNA作為標準品，-80°C保存。
[0009]對RT-qPCR的引物濃度、退火溫度等條件經(jīng)行摸索，以得到最佳的反應條件，反應體系為 20yL，其中 2 XOne Step SYBR RT-PCR Buffer 10yL；Ex Taq HS 0.4 yL；Primescript rt enzyme mix Π 0.4 yL; NDV F realtime-1、NDV F realtime-2弓丨物(10μΜ)各 lyL;Rnase Free dH20 5.2 yL;Total RNA 2 yL。反應條件確定為:42°C 反轉錄 5min; 95 °C 預變性3 min; 94 °C 10 s, 53°C 10s, 72°C 20 s，進行40 個循環(huán)的擴增，每個循環(huán)收集熒光信號。
[0010]最后根據(jù)反應條件的優(yōu)化，確定反應的檢測方法的標準曲線。選擇108、17、106、15、14、13拷貝/yL 6個濃度梯度的RNA標準品作為模板進行RT-qPCR擴增，每個濃度的標準品做3個重復，從而得到各自的動力學曲線，進而獲得標準曲線，并最終完成鑒別和定量檢測NDV強、弱毒的RT-qPCR方法的建立。
[0011]—種使用上述的PCR引物快速鑒別新城疫強毒株的方法，提取待鑒別毒株RNA，以此為模板，進行RT-qPCR擴增，當病毒核酸成功擴增時，則待鑒別病毒為NDV強毒株；當病毒核酸不能擴增時，則待鑒別病毒不是NDV強毒株。
[0012]有益效果:
本發(fā)明的鑒別方法只需要進行一次RT-qPCR擴增，就能判斷待檢病毒是否是NDV強毒株，檢測方法簡便、靈活易操作;檢測出的RNA最低濃度為I拷貝AxL，檢測靈敏度高;設計的引物只能擴增NDV強毒株，而對弱毒株和其他毒株都沒有擴增，特異性強。
【附圖說明】
[0013]圖1.反應條件的篩選
圖2.最佳反應條件的溶解曲線圖3.RT-qPCR擴增動力學曲線(單位:拷貝AxL)
其中1:1\108;2:1\107;3:1\106; 4: I X 105；5: I X 104；6: I X 13圖4.qPCR標準曲線
圖5.RT-qPCR敏感性試驗(單位:拷貝/yL)
其中:1:1\106;2:1\105;3:1\104 ；4: I X 103；5: I X 102；6: I X ΙΟ1；?: I X 10圖6特異性試驗其中:I.NDV 強毒株;2.ARV; 3.其他病毒(NDV 弱毒株、ARV、IBV、DHV、I LTV、TMUV)。
【具體實施方式】