獲取april結(jié)合肽的方法，產(chǎn)生該肽的過程，用所述方法/過程獲取的april結(jié)合肽以及該 ...的制作方法
【專利說明】獲取APR IL結(jié)合化的方法，產(chǎn)生該化的過程，用所述方法/過程 獲取的APR IL結(jié)合化從及該化的用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及人類醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)的領(lǐng)域，包括醫(yī)學(xué)/獸醫(yī)診斷和醫(yī)學(xué)/獸醫(yī)研究。更 具體地，本發(fā)明設(shè)及適合用于該領(lǐng)域或其他領(lǐng)域的APRIL結(jié)合膚，包括單克隆抗體。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] APRILWII型跨膜蛋白的形式表達(dá)，但不同于大多數(shù)其他TNF家族成員，其主要被 加工為分泌蛋白并且在高爾基體細(xì)胞器中裂解，在高爾基體細(xì)胞器中，通過弗林蛋白酶轉(zhuǎn) 化酶將其裂解W釋放可溶活性形式化opez-Fraga等人，2001 ,ΕΜΒΟ Rep2:945-51)。在蛋白 折疊中，APRIL組裝為與許多其他TNF家族配體具有類似結(jié)構(gòu)同源性的非共價(jià)連接的同源Ξ 聚體(WalIweber等人，2004，Mol Biol 343，283-90) dAPRIL結(jié)合兩個TNF受體:B細(xì)胞成熟抗 原(BCMA)和跨膜激活物-巧調(diào)節(jié)物-親環(huán)蛋白配體相互作用物(TACIK綜述于Kimberley等 人，2009,J Cell化ysiol.218(1): 1-8)。此外，最近表明APRIL能結(jié)合硫酸乙酷肝素蛋白多 糖化SPGK胎mlriks等人，2005，Cell Death Differ 12,637-48)。已表明APRIL在B細(xì)胞信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用，并且促使人和鼠類B細(xì)胞體外的增殖和存活（綜述于Kimberl巧等人， 2009，J Cell Physiol.218(1):1-8)。
[0004] APRIL主要通過免疫細(xì)胞亞群表達(dá)，如單核細(xì)胞、巨隧細(xì)胞、樹突細(xì)胞、中性粒細(xì) 胞、B細(xì)胞和T細(xì)胞，其中的許多細(xì)胞亞群還表達(dá)BAFF。此外，APRIL可通過非免疫性細(xì)胞表 達(dá)，如破骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞和各種腫瘤組織(綜述于Kimberley等人，2009,J Cell陸ysiol。 218(1) :1-8)。事實(shí)上，最初基于APRIL在癌細(xì)胞中的表達(dá)對其進(jìn)行鑒定化ahne等人，1998, J Exp Med 188,1185-90)。在一組腫瘤細(xì)胞系W及人原發(fā)性腫瘤(如結(jié)腸癌和淋己癌）中發(fā)現(xiàn) APRIL mRNA的高表達(dá)水平。
[0005] 對95例慢性淋己細(xì)胞性白血病(aL)患者的回顧性研究表明血清中有增加水平的 APRIL,其與疾病進(jìn)展和整體的患者存活相關(guān)，具有高APRIL血清水平的患者預(yù)后較差 。1曰1161163等人，2007，化6111曰扣1〇邑山曰92，1284-5)。同樣地，表明（增加水平）的4口1?比在霍 奇金淋己瘤、非霍奇金淋己瘤(N化)和多發(fā)性骨髓瘤(MM)中表達(dá)(綜述于Kimberley等人， 2009，J Ce 11 PhySi01.218(1): 1 -8)。對DLBCL患者（NHL)的回顧性研究表明癌灶中的高 APRIL表達(dá)與差的存活率相關(guān)(Schwaller等人，2007，Blood 109，331-8)。最近，表明患有結(jié) 腸直腸癌的患者血清中的A P RI L血清水平具有陽性診斷價(jià)值（D i η g等人，2 0 1 3， Clin. Biochemistry://dx.doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2013.06.008)。
[0006] 由于APRIL在B細(xì)胞生物學(xué)中的作用，其還在許多自身免疫性疾病中發(fā)揮作用。在 許多SLE患者中已報(bào)道APRIL的血清水平增加化oyama等人，2005，Ann化eum Dis 64，1065-7)。回顧性分析掲示了APRIL血清水平傾向于與抗dsDNA的抗體滴定度相關(guān)。另外，檢測到與 患有非炎癥性關(guān)節(jié)炎(如骨關(guān)節(jié)炎)的患者的滑液相比，具有炎癥性關(guān)節(jié)炎的患者的滑液中 明顯增加的APRIL水平（Stohl等人，2006，Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 6， 351-8;Tan等人，2003，A;rt虹itis I?he皿 48,982-92)。
[0007] 數(shù)種研究集中在患有更寬范圍的基于全身性免疫性的風(fēng)濕性疾?。壳斑€包括舍 格倫綜合征（SjGgrerr's syndrome)、賴特綜合征（Reiter ' s syndrome)、牛皮癖關(guān)節(jié)炎、 多肌炎和強(qiáng)直性脊柱炎）的患者血清中APRIL的存在，并且在運(yùn)些患者中發(fā)現(xiàn)明顯增加的 APRIL水平，其還表明APRIL在運(yùn)些疾病中的重要作用（Jonsson等人，1986, Scand J liheumatol Suppl 61，166-9;Roschke等人，2002，J Immunol 169,4314-21)。此外，在來自 患有異位性皮炎的患者血清中檢測到增加的APRIL血清水平（Matsushita等人，2007， E邱.Dermatology 17,197-202)。另外，在敗血癥中血清APRIL水平升高，并且預(yù)測危重癥患 者的死亡率（Roderburg等人，J. Critical Care，2013，http : //dx . doi . org/10.1016/ j . jcrc. 2012.11.007)。最后，增加的APRIL表達(dá)還與多發(fā)性硬化癥(MS)有聯(lián)系。與正常對照 相比，發(fā)現(xiàn)APRIL的表達(dá)在MS受害者（sufferers)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中增力日。運(yùn)與惡性膠質(zhì)瘤 W及惡性膠質(zhì)瘤患者的血清中所描述的APRIL表達(dá)一致（Deshayes等人，2004, Oncogene 23,3005-12;Roth等人，2001，Cell Death Differ 8,403-10)。
[000引發(fā)明概述
[0009] 因 APRIL是疾病的重要標(biāo)志物，如但不限于自身免疫性疾病、炎癥性疾病和惡性腫 瘤，所W檢測人類對象血清中的APRIL是重要的。當(dāng)前可用的分析設(shè)及(不明確且有限可用 的）多克隆抗體的使用（Planelles等人，2007，Haematologica 92,1284-5)，其不能再現(xiàn)已 報(bào)道的血清中APRIL水平，和/或APRIL的定量受人血清存在的嚴(yán)重影響(BioLegend，參見實(shí) 施例1)，在評估APRIL蛋白水平之前需要免疫球蛋白吸附步驟(Matsushita等人，2007， Exp.Dermatology 17,197-202)或者表現(xiàn)出有限的檢測限度(R&D系統(tǒng)）。鑒于現(xiàn)有技術(shù)抗 APRIL抗體的缺點(diǎn)，本發(fā)明的發(fā)明人著手研發(fā)鑒定和獲得適合于檢測人樣本，優(yōu)選血液來源 樣本(如血清樣本)的環(huán)境中APRIL的APRIL結(jié)合膚的方法。具體而言，設(shè)計(jì)和研發(fā)從APRIL免 疫小鼠選擇表達(dá)抗體的極少豐富的B細(xì)胞的方法。
[0010] 簡言之，獲得APRIL結(jié)合膚的本發(fā)明的方法包括W下步驟：
[0011] -提供結(jié)合物膚(binder P邱tide)的文庫；
[0012] -使用固體支持物上固定的祀膚通過親和選擇的手段從所述文庫選擇APRIL結(jié)合 膚，所述祀膚包含許多APRIL表位和APRIL的APRIL受體結(jié)合區(qū)；
[001引其特征在于，所述祀膚與包含APRIL受體或其APRIL結(jié)合等同物的APRIL結(jié)合區(qū)的 膚、屏蔽膚(shielding peptide)相互作用。用該種方法，可獲得和/或選擇APRIL結(jié)合膚。
[0014] 所研發(fā)的方法可被廣泛地開發(fā)，并且可被用來獲得廣泛的APRIL結(jié)合膚，如APRIL 結(jié)合抗體。
[0015] 本發(fā)明的其他方面設(shè)及用本發(fā)明的方法獲得的APRIL結(jié)合膚，包含本發(fā)明的APRIL 結(jié)合膚的編碼核巧酸序列的細(xì)胞，產(chǎn)生APRIL結(jié)合膚的過程W及用該過程獲得的APRIL結(jié)合 膚。此外，本發(fā)明的APRIL結(jié)合膚在診斷試驗(yàn)，優(yōu)選在離體診斷試驗(yàn)中的用途也在本發(fā)明的 范圍內(nèi)。
[0016] 序列簡述
[0017] 序列表中呈現(xiàn)的序列設(shè)及用本發(fā)明的方法獲得的五種免疫球蛋白化APRIL. 130、 MPRIL. 132、MPRIL. 133、MPRIL. 135、MPRIL. 138)的 Vh 和化鏈的氨基酸序列和編碼 DNA 序 列。此外，呈現(xiàn)運(yùn)些免疫球蛋白的Vh和化鏈的CDR區(qū)的氨基酸序列。下面的表1將序列ID與其 各自的序列關(guān)聯(lián)起來。
[001引 表1
[0019]
[0020]
[0021]
[0022] 附圖簡述
[0023] 圖1.檢測APRIL的可商購分析(獲自Biolegend)在血清的存在下不能重現(xiàn)對APRIL 的定量。來自結(jié)腸直腸癌患者的人血清含有不同量的人APRIL,其通過基于BCMA-Fc包被和 用于檢測的多克隆抗體的化ISA來檢測（X軸，如Planelles等人，化ematologica.2007Sep; 92(9): 1284-5所描述的分析)或用商用Biolegend ELISA檢測(y軸）。每個患者的兩種數(shù)值 之間的比較掲示由斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)(R = 〇,5964)所述的有限的關(guān)聯(lián)。
[0024] 圖2.使用當(dāng)前可商購分析的APRIL定量受到人血清存在的負(fù)面影響。使用用PBS+ 10 %胎牛血清+20 %人血清化S)(被稱為PBS-FCS-HS)稀釋或者用PBS/1 %BSA(被稱為PBS/ BSA)稀釋的濃度 100、33.3、11.1、3.7、1.23、0.41、0.136和0.04雌/1111的重組4口1?比生成兩條 標(biāo)準(zhǔn)曲線。在下列的分析中確定運(yùn)兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線的檢測:A)Biolegend ELISA，B)用BCMA-FC 包被并且用APRILY-5生物抗體檢測，C)用Sasha-2包被并且用APRILY-5抗體檢測，W及D)R& D HJSA。
[0025] 圖3.鑒定允許在血清中進(jìn)行檢測的APRIL結(jié)合膚的選擇策略。磁珠 (Magnetic DynaBeads)負(fù)載有BCMA-化重組蛋白，充分洗涂后，允許BCMA-化重組蛋白結(jié)合重組化AG-APRILo
[00%]圖4.本發(fā)明的APRIL單克隆檢測血清存在下的APRILdA. APRIL結(jié)合單克隆抗體被 用來檢測化L患者血清中的APRIL。使用Ξ例獨(dú)立患者的血清(化L1XLL3和化L6)，其表示不 同量的APRIL。所有APRIL結(jié)合抗體對該Ξ例不同患者中的APRIL展現(xiàn)出相似檢測，其不依賴 于捕獲APRIL的BCMA-Fc包被量（比較頂部（500ng/孔BCMA-Fc)與底部（lOOng/孔BCMA-Fc))。 B.使用表示不同量APRIL的十多個個體樣本(化L11-20)，用抗體MPRIL. 133確定化L患者血 清中的APRIL的檢測。
[0027] 圖5.使用BCMA-Fc和本發(fā)明的APRIL結(jié)合膚化APRIL. 133mAb)對APRIL進(jìn)行定量不 受人血清存在的影響。使用在PBS+10%胎牛血清+20%人血清化S)(被稱為PBS-FCS-HS)中 稀釋或在 PBS/1%BSA(被稱為 PBS/BSA)中稀釋的濃度 100、33.3、11.1、3.7、1.23、0.41、 0.136和0.04ng/ml的重組APRIL生成兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[002引發(fā)明詳述
[0029] 在獲得APRIL結(jié)合膚的本發(fā)明的的方法中，提供結(jié)合物膚的文庫。術(shù)語"文庫"是本 領(lǐng)域已知的，并且在該術(shù)語的已知含義中，"結(jié)合物膚的文庫"可被理解為意指不同的結(jié)合 物膚的收集物或陣列。膚文庫的環(huán)境內(nèi)的術(shù)語"結(jié)合物膚"或可選地"結(jié)合膚"可被理解為提 及具有結(jié)合其他化合物和/或結(jié)構(gòu)（具體而言為表位，更具體而言為膚表位）的潛在能力的 膚。在本發(fā)明中，具體而言，結(jié)合物膚具有潛在的APRIL結(jié)合能力。
[0030] 抗體(免疫球蛋白）和其結(jié)合片段是具有結(jié)合其他化合物和/或結(jié)構(gòu)(包括表位，如 膚表位）的潛在能力的已知膚。因此，在本發(fā)明中，具體而言，設(shè)想提供抗體或其片段的文 庫。技術(shù)人員知道如何獲得并且因此如何提供抗體或其片段的文庫。
[0031] 例如，可使用于W下文獻(xiàn)中所描述的技術(shù)從生成的抗體隧菌體文庫分離抗體或其 片段：McCafferty 等人，1990，化Uire，348:552-554 cXlackson 等人，1991，化Uire，352:624-628，和Marks等人，1991，J.Mol.Biol. 222:581-597，其分別地描述了利用隧菌體文庫分離 鼠和人抗體。隨后的出版物描述了通過鏈替換產(chǎn)生高親和力（nM范圍）的人抗體(Marks等 人，1992，Bio/Technology，10:779-783)，W及組合感染和體內(nèi)重組作為用于構(gòu)建非常大的 隧菌體文庫的策略(Waterhouse等人，1993，Nuc .Acids Res. 21:2265-2266)。
[0032] 可使用于W下文獻(xiàn)中所描述的技術(shù)從生成的mRNA展示文庫分離抗體或其片段： Rikuda等人，2006，Nuc. Ac ids Res.，34: e 127，其描述了利用mRNA展示文庫分離抗體片段。
[0033] 可選地，抗體文庫可包含淋己細(xì)胞，優(yōu)選脾細(xì)胞的收集物，其收集自用適合于引起 哺乳動物中APRIL特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)(agent)免疫的哺乳動物如非人哺乳動物。（非人） 哺乳動物的免疫W及收集脾細(xì)胞(或其他淋己細(xì)胞)是本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)實(shí)踐。適合于引起 APRIL特異性免疫應(yīng)答用于免疫的物質(zhì)可為APRIL蛋白或其部分，具體而言W純的形式，最 優(yōu)選W基本上純的形式。可選地，可使用APRIL或其部分的編碼核巧酸序列，優(yōu)選cDNA序列 通過DNA免疫實(shí)現(xiàn)免疫。DNA免疫的方法和操作（procedure)是技術(shù)人員已知的。DNA免疫的 示例性操作在實(shí)施例中呈現(xiàn)。
[0034] 除抗體(或抗體片段)的文庫之外，可提供在非免疫球蛋白的蛋白骨架上工程化的 結(jié)合膚的文庫。運(yùn)樣的蛋白骨架的實(shí)例包括但不限于Adnectins、Affibodies、Anticalins 和DARPins(Gebauer and Skerra'Current opinion 畑6111.13;[01.，2009，13:245-255和 C曰r曰veil曰曰nd Lugovskoy，Current opinion Chem. Biol.，2010，14:520-528)。選擇方法 例如包括隧菌體展示W(wǎng)鑒定表達(dá)APRIL結(jié)合膚的蛋白骨架。
[0035] 此外，可提供組合膚文庫作為結(jié)合物膚文庫。例如，一珠一化合物的組合文庫為在 珠上表達(dá)一大組的膚的文庫，其中一個珠結(jié)合一個膚。在選擇操作之后，將珠回收并且使用 例如質(zhì)譜法鑒定膚化 am 等人，Methods ,1996,9:482-93 ; Xiao 等人，Comb. Chem.High Throughput Screen,2013,Mar 13(epub 曰head of print)〇
[0036] 在獲得APRIL結(jié)合膚的方法中，通過親和選擇的手段從結(jié)合物膚的文庫選擇特異 性結(jié)合APRIL的膚。親和選擇操作利用在固體支持物上固定的祀膚。當(dāng)提及配體/受體、抗 體/抗原或其他結(jié)合對時(shí)，"特異性地"結(jié)合指示決定蛋白的異源群體和/或其他生物制品中 的蛋白（例如APRIL)存在的結(jié)合過程。因此，在指定的條件下，特異的配體/抗原結(jié)合具體的 受體/抗體，并且不顯著量地結(jié)合樣本中存在的其他蛋白。
[0037] 祀膚包含許多APRIL表位和APRIL的APRIL受體結(jié)合區(qū)。APRIL表位優(yōu)選來自APRIL 的APRIL受體結(jié)合區(qū)外部的區(qū)域。清楚地是，許多APRIL表位和APRIL的APRIL受體結(jié)合區(qū)可 適當(dāng)?shù)豔天然APRIL或其衍生物的形式提供。優(yōu)選使用天然的April作為祀膚。
[0038] 使用固定化配體用于選擇結(jié)合物膚的親和選擇操作是本領(lǐng)域已知的。例如淘篩或 生物淘篩操作是已知的。技術(shù)人員已知且清楚的是，通常的親和選擇操作包含Ξ個步驟:捕 獲，洗涂W及捕獲的結(jié)合劑的鑒定。
[0039] 對于本發(fā)明的方法中采用的親和選擇操作，所述捕獲步驟設(shè)及文庫的結(jié)合物膚與 包含APRIL的APRIL受體結(jié)合區(qū)的祀膚的結(jié)合。本領(lǐng)域已知的是，APRIL(目前)具有兩個已知 的自然受體，即BCMA和TACI。因此，術(shù)語APRIL受體可被理解為意指BCMA或TACI。盡管本發(fā)明 很大程度上示例使用BCMA作為APRIL受體，但是使用TACI同樣合適。參與結(jié)合APRIL的自然 受體的APRIL區(qū)域是已知的化ymowitz等人，2005, J. Biol.化em280:7218-7227)。祀膚W允 許結(jié)合APRIL受體(或其結(jié)合等同物）的形式包含該APRIL的APRIL受體結(jié)合區(qū)。祀膚被固定 在固體支持物上W允許鑒定和/或分離與所選擇的祀標(biāo)特異性地相互作用的結(jié)合物膚。術(shù) 語"固定"應(yīng)被理解為意指具有有限的或減少的流動性。所述有限的或減少的流動性與洗涂 步驟中使用的洗涂介質(zhì)有關(guān)。"固定的"祀膚不需要與固體支持物直接地結(jié)合或與其相互作 用。相反，它可W和與固體支持物結(jié)合或與其相互作用的化合物或部分具有相互作用。膚的 固定手段的實(shí)例包括但不限于與塑料的非特異性吸附、與珠的NH2-禪合、與甲苯橫酷活化 珠的結(jié)合或與蛋白A珠的結(jié)合。用于將膚固定在固體支持物上的方法是技術(shù)人員清楚的。
[0040] 本發(fā)明的方法中采用的親和選擇操作中的祀膚包含APRIL的APRIL受體結(jié)合區(qū)和 許多APRIL表位。APRIL的APRIL受體結(jié)合區(qū)可完整的APRIL蛋白或部分APRIL蛋白的形 式呈現(xiàn)。APRIL蛋白或其部分的序列優(yōu)選為人來源。APRIL表位可呈現(xiàn)于APRIL的APRIL受體 結(jié)合區(qū)或祀膚的不同部分。APRIL的APRIL受體結(jié)合區(qū)和APRIL表位的選擇使得祀膚與屏蔽 膚的結(jié)合相互作用是可能的。在本說明書和所述的權(quán)利要求書中，除非特別區(qū)分性地說明， 否則每次使用術(shù)語"許多"時(shí)，應(yīng)被理解為意指一個或多個，如1、2、3、4、5、6、7或更多。
[0041] 在獲得APRIL結(jié)合膚的本發(fā)明的方法中，祀膚(包含APRIL的APRIL結(jié)合區(qū)和許多 APRIL表位）W與包含APRIL受體的或其APRIL結(jié)合等同物的APRIL結(jié)合區(qū)的屏蔽膚相互作用 的方式被固定在固體支持物上。APRIL受體的APRIL結(jié)合區(qū)可W W完整的APRIL受體蛋白或 部分APRIL受體蛋白的形式呈現(xiàn)。APRIL受體蛋白或其部分的序列優(yōu)選為人來源。
[0042] 作為用于APRIL受體蛋白的APRIL結(jié)合區(qū)的替換物，可使用運(yùn)樣的APRIL受體蛋白 的APRIL結(jié)合等同物的APRIL結(jié)合區(qū)。APRIL受體蛋白的APRIL結(jié)合等同物可為例如與APRIk APRIL受體界面處的APRIL結(jié)合的膚，如抗體。運(yùn)樣的膚可選自干擾APRIL和許多它的受體 (BCMA或TACI)的相互作用的膚。例如在W02010/100056中公開的hAPRIL.OlA抗