鹽堿條件下甘油向1,3-丙二醇的轉(zhuǎn)化的制作方法
【專利說明】鹽堿條件下甘油向1，3-丙二醇的轉(zhuǎn)化
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年9月6日提交的、題為"鹽堿條件下甘油向1,3-丙二醇的轉(zhuǎn)化" (Conversion of Glycerol to 1,3-Propanediol Under Haloalkaline Conditions)的美 國臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/874,752的優(yōu)先權(quán)，該文的全部?jī)?nèi)容通過引用納入本文。
[0003] 序列表
[0004] 本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式(CRF)的序列表，其W名為"序列表"的ASCn文本格式 (2014年8月28日生成，大小為20邸)提交。CRF的內(nèi)容通過引用納入本文。
[0005] 背景
技術(shù)領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明將提供一種供于生物柴油公司從廢產(chǎn)物(甘油)形成有價(jià)值的產(chǎn)物（1,3-丙 二醇）的方法。
[0007] 相關(guān)技術(shù)的描述
[000引化學(xué)廢料能夠回收成有用的化合物。隨著近期生物柴油生成的激增，甘油已經(jīng)從 相對(duì)特殊的日用品成為了嚴(yán)重過度生成的廢產(chǎn)物。許多大型化學(xué)與農(nóng)業(yè)公司已試圖尋找甘 油的高效轉(zhuǎn)化方式。一種主要工藝是通過微生物代謝將甘油轉(zhuǎn)化成1,3-丙二醇。已經(jīng)成功 地鑒定了能夠進(jìn)行該反應(yīng)的微生物菌株;然而，其在商業(yè)上可能不太可行，因?yàn)榇指视彤a(chǎn)物 需要被處理?？紤]到經(jīng)濟(jì)上的可行性，該工藝必須能夠采用有限的處理就能將粗甘油產(chǎn)品 轉(zhuǎn)化成1,3-丙二醇。例如，1,3-丙二醇，作為許多常見產(chǎn)物的構(gòu)件塊(building block)常用 于化學(xué)工業(yè)，所述常見產(chǎn)物例如粘合劑、香料和香水、個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品，W及涂料諸如漆。目 前，1,3-丙二醇從粗油組分、丙締或環(huán)氧乙燒，或源自玉米的葡萄糖合成。然而，用于回收化 學(xué)廢料的常見的化學(xué)加工設(shè)及使處理流對(duì)于用于生物轉(zhuǎn)化的細(xì)菌來說更具耐受性。通過添 加大量的酸或堿，或采用大量的能量來移除鹽和雜質(zhì)，工業(yè)上提供適于非極端微生物生存 的條件。甘油是生物柴油生成的另一種常見廢產(chǎn)物，其可被轉(zhuǎn)化成有用的化合物。隨著近期 生物柴油生成的激增，甘油已經(jīng)從相對(duì)特殊的日用品成為了嚴(yán)重過度生成的廢產(chǎn)物。許多 大型化學(xué)與農(nóng)業(yè)公司已試圖尋找甘油的高效轉(zhuǎn)化方式。主要處理目標(biāo)之一是通過微生物代 謝將甘油轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇（圖1)。已經(jīng)成功地鑒定了能夠進(jìn)行該反應(yīng)的微生物菌株;然 而，其在商業(yè)上可能不太可行，因?yàn)榇指视彤a(chǎn)物需要被處理。就甘油會(huì)增加施于細(xì)菌上的壓 強(qiáng)而言，甘油的作用方式與鹽非常類似?？紤]到經(jīng)濟(jì)上的可行性，該工藝必須能夠采用有限 的處理就能將粗甘油產(chǎn)品轉(zhuǎn)化成1,3-丙二醇。因此，仍需要將化學(xué)廢料轉(zhuǎn)化成有用的化合 物和產(chǎn)物的改善的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明通過提供一種生成1,3-丙二醇的方法而解決了上述問題。所述方法包括使 鹽厭氧菌化alanaerobium)與甘油源發(fā)酵，由此產(chǎn)生1,3-丙二醇。發(fā)酵可在高抑和高鹽濃度 下進(jìn)行，并且無需從甘油原料移除雜質(zhì)?？赏ㄟ^向發(fā)酵培養(yǎng)物補(bǔ)充維生素 Bi2來提高發(fā)酵轉(zhuǎn) 化率。
[0010]附圖的簡(jiǎn)要說明
[OOW 圖1說明將甘油轉(zhuǎn)化成1,3-丙二醇的過程；
[001^ 圖視鹽厭氧菌嗜鹽堿(haloalkaliphilic)物種的掃描電子顯微鏡(SEM)照片； [001引圖視甘油消耗的散點(diǎn)圖；
[0014] 圖4是甘油消耗的散點(diǎn)圖；
[0015] 圖5是1,3-丙二醇生成的散點(diǎn)圖；
[0016] 圖6是1,3-丙二醇生成的散點(diǎn)圖；
[0017] 圖7顯示的散點(diǎn)圖顯示峰高度和峰面積之間的甘油濃度比較；
[0018] 圖8顯示的散點(diǎn)圖顯示峰高度和峰面積之間的1,3-丙二醇濃度比較;和
[0019] 圖9的圖顯示增加維生素 Bi2的濃度對(duì)1,3-丙二醇生成(轉(zhuǎn)化)的影響。
[0020] 優(yōu)選實(shí)施方式詳述
[0021] 本發(fā)明提供一種用于發(fā)酵生成1,3-丙二醇的方法，該方法無需進(jìn)行當(dāng)前所需步 驟:預(yù)處理、脫鹽或中和W降低原料或發(fā)酵培養(yǎng)基的鹽度或抑，或移除通常存在于粗原料中 的廢料副產(chǎn)物。本發(fā)明方法能夠經(jīng)調(diào)整W適應(yīng)更大規(guī)模、商業(yè)或工業(yè)應(yīng)用W從化學(xué)廢料的 微生物發(fā)酵中生成作為有用前體物質(zhì)的1,3-丙二醇，所述化學(xué)廢料具體是包含甘油或甘油 源的化學(xué)廢原料，所述方法W低成本且環(huán)境友好的方式進(jìn)行。
[0022] 本發(fā)明方法采用能夠在未處理的化學(xué)廢料的存在下旺盛生長(zhǎng)的極端微生物。具體 而言，優(yōu)選微生物是產(chǎn)氨鹽厭氧菌化alanaerobium hy化ogeniformans) (ATCC專利保藏編 號(hào)PTA-10410,保藏于2009年10月13日），其在高抑(約pH 11，其類似于洗涂清潔劑)和高鹽 濃度(7%鹽，是海洋水平的兩倍)的條件下生長(zhǎng)。在用于產(chǎn)生生物燃料(如乙醇和氨）的經(jīng)處 理的生物質(zhì)，W及在生物柴油生成過程中生成的粗甘油中存在運(yùn)些條件。
[0023] 化學(xué)廢原料的發(fā)酵采用能夠在高堿和超鹽條件生成1,3-丙二醇的嗜鹽堿微生物 完成。產(chǎn)氨鹽厭氧菌能夠在pH 11和7%鹽的極端條件下，將甘油，生物柴油生成的常見廢產(chǎn) 物，轉(zhuǎn)化成為1,3-丙二醇。在優(yōu)選實(shí)施方式中，采用該方法能獲得約55%的轉(zhuǎn)化率。有利的 是，該微生物還能在包含多達(dá)1M甘油的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并且能夠在包含粗廢料甘油的溶液 中旺盛生長(zhǎng)。
[0024] 不同于鹽厭氧菌化alanaerobium)屬的其它成員，該微生物是高度嗜堿性的，并且 在約10.5至約11的抑下有最優(yōu)生長(zhǎng)。用于本發(fā)明方法的合適的微生物優(yōu)選地具有包含SEQ ID N0:1(或由SEQ ID N0:1組成）的16S核糖體DNA(rDNA)序列，或與SEQ ID N0:1具有至少 98%序列同源性，且更優(yōu)選地，與SEQ ID N0:1具有至少99%序列同源性的16S rDNA序列。 合適的微生物將優(yōu)選地具有編碼甘油脫水酶或有甘油脫水酶活性的酶的至少一個(gè)基因，并 且優(yōu)選地具有編碼甘油脫水酶或有甘油脫水酶活性的酶的內(nèi)源性基因。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施 方式中，所述微生物包含內(nèi)源性DNA序列，所述內(nèi)源性DNA序列含有（或由其組成）SEQ ID NO: 2或與SEQ ID NO: 2具有至少98%序列同源性、更優(yōu)選與SEQ ID NO: 2具有至少99%序列 同源性的序列。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，所述微生物包含編碼內(nèi)源性蛋白質(zhì)的基因，所述 內(nèi)源性蛋白質(zhì)含有（或由其組成）SEQ ID N0:3,或與SEQ ID N0:3具有至少98%序列同源 性、更優(yōu)選地與SEQ ID NO:3具有至少99%序列同源性的序列，。
[0025] 合適的微生物將優(yōu)選具有編碼含鐵醇脫氨酶或有醇脫氨酶活性的酶的至少一個(gè) 基因，并且優(yōu)選地，編碼含鐵醇脫氨酶或具有醇脫氨酶活性的酶的內(nèi)源性基因。在一個(gè)或多 個(gè)實(shí)施方式中，所述微生物包含內(nèi)源性DNA序列，所述內(nèi)源性DNA序列含有(或由其組成）SEQ ID NO:4或與SEQ ID NO:4具有至少98%序列同源性、更優(yōu)選與SEQ ID NO:4具有至少99% 序列同源性的序列。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，所述微生物包含編碼內(nèi)源性蛋白質(zhì)的基因， 所述內(nèi)源性蛋白質(zhì)含有(或由其組成)SEQ ID N0:5,或與SEQ ID N0:5具有至少98%序列同 源性、更優(yōu)選地與SEQ ID N0:5具有至少99%序列同源性的序列。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式 中，所述微生物包含內(nèi)源性DNA序列，所述內(nèi)源性DNA序列含有(或由其組成）SEQ ID N0:6， 或與SEQ ID N0:6具有至少98%序列同源性、更優(yōu)選與SEQ ID N0:6具有至少99%序列同源 性的序列。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，所述微生物包含編碼內(nèi)源性蛋白質(zhì)的基因，所述內(nèi)源 性蛋白質(zhì)含有（或由其組成）SEQ ID N0:7,或與SEQ ID N0:7具有至少98%序列同源性、更 優(yōu)選地與SEQ ID N0:3具有至少99%序列同源性的序列。合適的微生物包括保留了產(chǎn)氨鹽 厭氧菌的嗜鹽堿性質(zhì)的微生物的突變體和衍生物(子代）。突變體(例如上述序列中缺失、插 入和/或替代一個(gè)堿基)包括在所述微生物的傳代或培養(yǎng)中自發(fā)發(fā)生的那些，W及故意突變 的那些。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式中，