量子分子測序(qm-seq)：dna、rna和單核苷酸修飾的獨(dú)特納米電子隧穿光譜學(xué)指紋的鑒定的制作方法
【專利說明】量子分子測序(QM-化Q):DNA、RNA和單核音酸修飾的獨(dú)特納米 電子隧穿光譜學(xué)指紋的鑒定
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請依據(jù)35U.S.C.§119(e)，要求2013年9月13日提交的美國專利申請第61/ 877，634號的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，該專利申請通過引用整體并入本文。
[000引領(lǐng)域
[0004]本公開的方法、裝置、組合物和系統(tǒng)設(shè)及核酸的鑒定和測序。
[000引背景
[0006] 用于個性化醫(yī)療和快速演化的遺傳學(xué)領(lǐng)域的新的診斷工具需要廉價、快速、可靠、 不含酶和高通量的測序技術(shù)。雖然最近開發(fā)的幾個DNA測序技術(shù)已試圖減少測序成本和時 間，但報導(dǎo)的核酸序列是統(tǒng)計(jì)上顯著的總體平均值。雖然運(yùn)些總體平均值可用于得出核酸 序列與生理行為之間的某種關(guān)系，但遺傳變異或突變的痕量水平可主導(dǎo)生物學(xué)功能。運(yùn)通 過細(xì)菌或超級細(xì)菌的多重耐藥菌株W及通常在藥物治療之前W痕量存在的快速突變病原 體的快速出現(xiàn)來舉例說明。牽設(shè)抗藥性編碼DNA序列諸如β-內(nèi)酷胺酶(其引起對基于青霉素 的抗生素的抗性）的快速鑒定的最近研究已顯示運(yùn)些技術(shù)是適時提供祀向醫(yī)療干預(yù)，從而 加強(qiáng)對用于快速和高通量測序的可靠單核巧酸測序工具的需要所必需的。目前的二代測序 技術(shù)能夠使用深度和超深(約100個讀數(shù)/多核巧酸)測序法和單拷貝PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)） 擴(kuò)增檢測單核巧酸多態(tài)性(SNP)。然而，運(yùn)些方法非常昂貴并且技術(shù)復(fù)雜，從而使得它們難 W應(yīng)用于臨床情況。雖然最近的研究已概述了單細(xì)胞基因組用于醫(yī)學(xué)和非侵入性臨床應(yīng)用 的潛在用途，但運(yùn)些研究包括從單個分子進(jìn)行的DNA的酶促擴(kuò)增和使用常規(guī)測序工具(光學(xué) 標(biāo)記）的DNA測序。因此，用于DNA的鑒定的當(dāng)前技術(shù)依賴于基于酶的DNA擴(kuò)增，基于酶的DNA 擴(kuò)增可引入序列偏差W及可潛在地導(dǎo)致痕量或單細(xì)胞樣品的DNA序列檢測中的錯誤。其它 新的技術(shù)已試圖通過使用核酸標(biāo)記和只允許DNA分子的測序的特定的酶在從頭測序中減少 測序錯誤。
[0007] DNA序列的電子鑒定為下一代測序技術(shù)的候選者，因?yàn)槠淇商峁o DNA擴(kuò)增的無酶 技術(shù)。該方法可提供減少處理時間和與其它技術(shù)相關(guān)的錯誤的可能性。幾個研究小組已使 用基于沿孔離子電流的變化或隧穿電流衰減（當(dāng)堿基穿過孔時）的DNA核巧酸的納米孔電導(dǎo) 進(jìn)行開發(fā)。在運(yùn)些實(shí)驗(yàn)中，使DNA穿過在其中探測其結(jié)構(gòu)的非常小的空穴。然而，該方法缺乏 單分子分辨能力并且因核巧酸修飾而遭受不足的電導(dǎo)變化困擾，從而限制其用于診斷和表 基因組學(xué)鑒定的潛在用途。其它研究已研究用于單分子檢測和鑒定的掃描隧道顯微鏡術(shù)。 雖然已實(shí)現(xiàn)了使用隧道顯微鏡術(shù)對單DNA分子的成像，但都未提供用于單個核巧酸、核巧和 核堿基的準(zhǔn)確、可重復(fù)和高效的鑒定和區(qū)分的可靠方法或裝置或?qū)哂卸鄠€核巧酸、核巧、 核堿基及其組合的分子中的核巧酸、核巧和核堿基測序的能力。
[0008] RNA測序提出了獨(dú)特挑戰(zhàn)。近年來，大規(guī)模平行RNA測序已使得能夠進(jìn)行基因表達(dá) 的高通量定量和稀有轉(zhuǎn)錄物的鑒定，包括小RNA表征、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)鑒定等等。然而，大多數(shù) RNA測序法依賴于cDNA合成W及許多在多個水平上引入偏差的操作，包括利用隨機(jī)六聚體 的引發(fā)、連接、擴(kuò)增和測序。此外，許多常見的天然(5-甲基胞喀晚、假尿巧)和化學(xué)修飾(N7- 甲基鳥嚷嶺)在cDNA合成期間不停止逆轉(zhuǎn)錄酶，從而不能使用高通量DM測序法檢測出來。 還已知常用逆轉(zhuǎn)錄酶向cDNA中引入假象，例如刪除RNA二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域中的核巧酸的傾向。 運(yùn)導(dǎo)致所得cDNA中的測序模式的模糊。此外，已發(fā)現(xiàn)未被目前測序技術(shù)檢測出的DNA甲基化 為癌細(xì)胞的顯性標(biāo)記，從而可用于區(qū)分在癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞之間存在的體細(xì)胞變化。
[0009] 概述
[0010] 本文中公開的技術(shù)、方法、裝置和組合物可用于測定未知核巧酸、核巧或核堿基的 身份，其中方法包括通過量子隧穿分析未知的核巧酸、核巧、核堿基，測定未知的核巧酸、核 巧和核堿基的一個或多個電子參數(shù)，使用電子參數(shù)測定核核巧酸、核巧和核堿基的特征，將 未知的堿基的電子特征與一個或多個已知的核巧酸、核巧和核堿基的電子指紋相比較，使 未知核巧酸、核巧和核堿基的電子特征與已知堿基(例如，修飾的和未被修飾的DNA核巧酸 腺嚷嶺，A、胸腺喀晚，T、鳥嚷嶺，G、胞喀晚，C、RNA核巧酸A、G、C、尿喀晚，U、膚核酸(PNA)和其 它人工核酸大分子、核巧酸修飾如甲基化、5-簇基、5-甲酯基、5-徑甲基、5-甲基脫氧、5-甲 基、5-徑甲基、N6-甲基脫氧腺巧，W及用于測定RNA二級/Ξ級結(jié)構(gòu)的其它修飾如N-甲基說 紅酸酢(醒IA)或硫酸二甲醋(DMS))的電子指紋匹配，和由此鑒定未知的核堿基、核堿基修 飾或核酸大分子二級/Ξ級結(jié)構(gòu)。在許多實(shí)施方案中，當(dāng)核堿基在特定的化學(xué)條件或環(huán)境， 例如選自酸性、中性或堿性抑的pH環(huán)境中時，可測定未知的核堿基的電子特征。在許多實(shí)施 方案中，核堿基的電子特征被生化條件，例如，pH值環(huán)境改變。在一些實(shí)施例中，在酸性環(huán)境 中測定未知的核堿基的身份，在酸性環(huán)境中可區(qū)分各種修飾的和未修飾的核堿基。在許多 實(shí)施例中，鑒定未知的核堿基的所公開的方法可包括計(jì)算裝置，其包含一個或多個標(biāo)準(zhǔn)電 子指紋和將未知的核堿基的電子特征與一個或多個標(biāo)準(zhǔn)電子指紋匹配。
[0011] 所公開的技術(shù)可用于通過標(biāo)記多核巧酸的5'末端來測定多核巧酸(或具有一個或 多個核巧酸、核巧、核堿基或其組合的其它大分子）的3'->5'順序。在許多情況下，多核巧 酸是指包含一個或多個核巧酸、核巧、核堿基或其組合的大分子。在一些實(shí)施方案中，運(yùn)通 過連接特定的5'或3'末端特定引物標(biāo)簽(在一些情況下通過使用T4連接酶產(chǎn)生具有已 知序列的5'-和3'-末端的模板來實(shí)現(xiàn)。通過使用公開的方法、裝置和組合物，將鑒定多核巧 酸(或包含一個或多個核巧酸、核巧、核堿基或其組合的其它聚合分子)的序列，序列將顯示 未知DNA/RNA/PNA樣品的方向性。
[0012] 此處描述的微流體裝置可用于改變pHW同時或幾乎同時測定兩個或更多個不同 環(huán)境條件中的核堿基的電子特征是。使用微流體通道可從單個DNA空穴填充DNA(例如單鏈 DNA)，如圖26中顯示的，其中用不同的聚合電解質(zhì)(聚陰離子和聚陽離子)涂覆通道，W改變 和維持環(huán)境的抑至所需值。隨后可將單個金屬尖頭或多個尖頭(例如，如下文中針對并行測 序所描述的）用于在不同的pH環(huán)境和其它生化條件中對核堿基進(jìn)行測序。
[0013] 還公開的是可使用本文中描述的獨(dú)特電子指紋鑒定多個未知的核巧酸/核堿基， 其中電子指紋包含一個或多個生物物理電子參數(shù)諸如HOMO能級、LUM0能級、帶隙、電子和空 穴的福勒-諾德漢(Fowler-Nor化eim)轉(zhuǎn)變電壓、隧穿曲線的斜率、電子和空穴的隧穿勢壘 高度的差異、電子和空穴的有效質(zhì)量、不同生化條件下的電子和空穴的有效質(zhì)量的比率等 的值?？刹煌M合使用運(yùn)些生物物理電子參數(shù)W鑒定未知的、經(jīng)修飾的或未被修飾的 核巧酸/核堿基。在許多情況下，未知核巧酸/核堿基的身份可高置信度來測定。所公開 的方法可包括聚類法(其中使用許多已知的核堿基/核巧酸的一個或多個生物物理電子參 數(shù)來產(chǎn)生電子指紋，可將電子指紋與針對未知的核堿基/核巧酸測定的電子指紋相比較)的 使用。在許多情況下，將電子參數(shù)作為電子數(shù)據(jù)存儲在計(jì)算機(jī)程序中，該計(jì)算機(jī)程序可用于 選擇針對未知核堿基/核巧酸測定的電子參數(shù)和與已知核巧酸/核堿基的類似地配置的指 紋(包含與針對電子特征所選擇的參數(shù)相同的參數(shù)的值)比較。所公開的方法可用于對用于 魯棒測序技術(shù)和軟件分析的核堿基進(jìn)行自動化測序和調(diào)用。
[0014] 還公開了用于測定未知核堿基的身份的組合物。在一些實(shí)施方案中，公開了用于 測定核堿基的身份的基片，其中底物可W是光滑的高度有序的金基片，例如Au(lll)。在一 些實(shí)施方案中，基片帶電荷并用包含一種或多種離子分子例如多聚k賴氨酸的溶液進(jìn)行處 理，其中離子分子可幫助將帶負(fù)電荷的聚合物，諸如單鏈DNA連接于金基片。
[0015] 還使用所公開的方法測定核巧酸/核堿基的化學(xué)修飾。在一些情況下，化學(xué)修飾可 用于測定多核巧酸或包含一個或多個核巧酸、核巧、核堿基或其組合的其它聚合分子的二 級/Ξ級核酸大分子結(jié)構(gòu)。在一些情況下，可使用N-甲基說紅酸酢(醒IA)、硫酸二甲醋(DMS) 等修飾多核巧酸。DNA/RNA/PNA的化學(xué)修飾還可用于測定表觀遺傳標(biāo)記和核酸損傷。在一些 情況下，化學(xué)修飾可W是5-簇基、5-甲酯基、5-徑甲基、5-甲基脫氧、5-甲基、5-徑甲基、N6-甲基-脫氧腺巧等。可使用所公開的電子指紋利用未被修飾的DNA/RNA/PNA核巧酸同時測定 化學(xué)修飾。
[0016] 雖然公開了多個實(shí)施方案，但根據(jù)下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它實(shí)施方案對于本 領(lǐng)域技術(shù)人員仍將是顯然的。顯而易見，可通過各種描述的方面的改進(jìn)實(shí)施本發(fā)明，其全都 不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，詳細(xì)描述將被認(rèn)為實(shí)質(zhì)上是說明性且非限制性的。
[0017] 附圖簡述
[001引圖la至圖Ig使用量子分子測序(QM-Seq)測定核酸大分子如DNA、RNA、PNA的序列。 (a)顯示沉積在潔凈Au (111)表面上的單鏈(S S) DNA的如anT-Seq的圖示。Ξ步驟擠出沉積方 案用于可重現(xiàn)地獲得具有減小的構(gòu)型賭的伸展的線性化DNA和RNA分子。用于獲得QM-Seq電 子譜(隧穿數(shù)據(jù)）的金屬尖端用作"讀取頭"，（b)QM-Seq利用貫穿核巧酸的電子和空穴的納 米電子隧穿來提供獨(dú)特的電子指紋。顯示了酸性條件下的嚷嶺和喀晚的前線帶結(jié)構(gòu)、HOMO 和LUM0分子軌道的示意圖，其中觀察到兩種核堿基(未按比例繪制的）之間的顯著差異。綴 合的不同程度和化學(xué)上不同的核堿基(此處為腺嚷嶺和胸腺喀晚）導(dǎo)致不同的電子態(tài)和能 隙，（c-g)具有其對應(yīng)化學(xué)結(jié)構(gòu)的每一個(脫氧)核糖核巧酸的代表性QM-Seq譜(隧穿數(shù)據(jù)）。 R-可W分別地是脫氧核糖核巧酸(DNA)和核糖核巧酸(RNA)的Η或0H。在酸性條件下測量譜 數(shù)據(jù)。此處顯示的譜對應(yīng)于DNA核巧酸(A、C、G、T)和RNA核巧酸化）。顯示的結(jié)構(gòu)為(C)(脫氧） 腺巧5'-單克憐酸，（d)(脫氧)鳥巧5'-單克憐酸，（e)(脫氧)胞巧5'-單憐酸，（f)胸巧5'-單 憐酸和(g)尿巧5'-單憐酸。A、G、C、T/U核巧酸總是分別用綠色、黑色、藍(lán)色和紅色標(biāo)示。
[0019] 圖2a至圖化核堿基、脫氧核巧和核糖核巧的前線分子軌道:利用(a)作為嚷嶺實(shí)例 的腺嚷嶺、脫氧腺巧和腺巧;和(b)作為喀晚實(shí)例的胞喀晚、脫氧胞巧和胞巧的B3LYP函數(shù)和 6-311G(2d，2p)基組，使用密度函數(shù)理論(DFT)計(jì)算的H0M0、LUM0分子軌道結(jié)構(gòu)。陰影表示波 函數(shù)的不同相。
[0020] 圖3a至圖3f使用掃描隧道顯微鏡術(shù)-掃描隧穿光譜學(xué)(STM-STS)測定單DNA分子的 序列。（a)顯示DNA加工方案的圖示。使用劑壓沉積技術(shù)將變性的單鏈(ss)DNA沉積在利用聚 k賴氨酸修飾的潔凈Au( 111)表面上，W可重現(xiàn)地獲得用于測序的細(xì)長的線性化DNA模板。 (b)獲得沉積在帶正電荷的Au (111)表面上的s sDNA核巧酸的狀態(tài)(DOS)譜的形貌圖象I -V和 dl/dV或密度的STM-STS的示意圖。使用電隧穿電流數(shù)據(jù)提供貫穿單個核巧酸的電子和空穴 隧穿的隧穿概率。在可能的情況下，A、G、C、T核巧酸通過不同的陰影來區(qū)分。（c-f)中性抑下 的DNA核巧酸（單憐酸）、腺巧5'-單憐酸（C)、脫氧鳥巧5'-單憐酸(d)、脫氧胞巧5'-單憐酸 (e)和脫氧胸巧5'-單憐酸(f)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0021 ]圖4a至圖4f使用STM-STS獲得的DNA核巧酸的電子指紋，（a)酸性條件（利用0.1M 肥1洗涂的表面)下的A、G、C和T的冊M0(負(fù)）和LUM0(正)能級的分布。LUM0能級（正電壓峰值） 的明確分離用于鑒定喀晚(C、T)與嚷嶺(A、G)，并且HOMO能級的差異用于分開喀晚(C與T)。 (b)酸性條件下的LUM0與冊M0能級之間的能隙。（C)酸性化C1)、中性化2〇)和堿性(化0H)pH 條件下的胸巧的H0M0/LUM0能級。箭頭指示酸性、中性與堿性pH條件之間的LUM0能級的轉(zhuǎn) 變。（d)不同pH條件下的胸腺喀晚的生化結(jié)構(gòu)，包括酸性條件下的酬式-締醇式互變異構(gòu)，和 中性與堿性條件之間的酸-堿行為，（e)特征在于其轉(zhuǎn)變電壓(Vtrans)及Ξ角形隧穿的斜率 (與隧穿能量勢壘成比例）的酸性條件下的胸腺喀晚的電子福勒-諾德漢曲線。在每一個小 的電壓上，隧穿變成梯形/矩形，從而顯示來自線性斜率(斜率變成對數(shù)型）的偏差。（f)對于 所有4種核巧酸的酸性條件下的電子(Vtrans,e-)和空穴(Vtrans,h+)的轉(zhuǎn)變電壓的概率密度函 數(shù)。福勒-諾德漢隧穿的Vtrans, eVVtrans, h+和斜率(S )分別顯示與冊M0/LUM0能級相同的行為 及其能量帶隙Γ帶隙"）。
[0022] 圖5a至圖5f DNA核巧酸的電子指紋，（a)酸性條件下的多聚賴氨酸修飾的表面 (用0.1M HC1洗涂的）上的A、G、C和T的測量的HOMO(負(fù)）和LUM0(正)能級的箱形圖。箱形圖含 有第二和第Ξ四分位數(shù)(25-75%)，而細(xì)須顯示5-95%的數(shù)據(jù)。LUM0能級(正電壓峰值)的明 確分離用于在質(zhì)子化分子中鑒定喀晚(C、T)與嚷嶺(A、G)，并且HOMO能級的差異用于區(qū)分嚷 嶺(C與門?；?酸性條件下的LUM0與HOMO能級之間的能隙。該能隙可與中性分子不同。（C)酸 性化C1)、中性化2〇)和堿性(NaOH)pH條件下的胸腺喀晚的H0M0/LUM0能級。（d)不同抑條件 下的胸腺喀晚的生化結(jié)構(gòu)，包括酸性條件下的酬式-締醇式互變異構(gòu)，和中性與堿性條件之 間的酸-堿行為。（e)對于所有4種核巧酸的酸性條件下的電子(Vtrans,e-)和空穴(Vtrans,h+)的 轉(zhuǎn)變電壓的分布。Vtrans, e-Vtrans, h+分別顯示與H0M0-LUM0能級相同的行為及其能量帶隙。（f ) 特征在于其轉(zhuǎn)變電壓(Vtrans,e-)及Ξ角形隧穿的斜率(與隧穿能量勢壘成比例）的酸性條件 下的胸腺喀晚的電子福勒-諾德漢曲線。示意圖顯示從低電壓下的直接隧穿至高偏壓下的 Ξ解形隧穿的轉(zhuǎn)變。在極低電壓(0偏壓限制）下，勢壘變成矩形并且隧穿電流顯示具有施加 的偏壓的對數(shù)型斜率。
[0023] 圖6a至圖6d使用STM-STS對β-內(nèi)酷胺酶基因 ampR的測序。（a)酸性條件下的多聚k 賴氨酸修飾的金上的腺嚷嶺的表征。綠色實(shí)線顯示dl/dV或態(tài)密度，灰色虛線為I-V數(shù)據(jù)，并 且綠色點(diǎn)線顯示HOMO和LUM0能級的分布。（b)1091nt ampR基因的單個ssDNA分子的STM圖 像。圖像顯示DNA在多聚レ賴氨酸修飾的金基片頂部被線性化，從而允許容易的STS鑒定。 (C)使用STM-STS測量的，在酸性條件下使用A、G、C和T的電子指紋進(jìn)行的（b)中突出顯示的 區(qū)域中的DNA核巧酸的鑒定。對所鑒定的核巧酸進(jìn)行顏色編碼（黑色:A或G，藍(lán)色：CW及紅 色：TK(d)基于使用來自（C)的STS數(shù)據(jù)的第一（突變顯示的）和第二鑒定的鑒定的ampR序 列。
[0024] 圖7a至圖7d RNA核巧酸的電子指紋和與DNA的比較：（a)酸性條件下的RNA核巧酸 的單分子測量的系綜的冊MO和LUMO能量的箱形圖，箱包含25-75%，而細(xì)須顯示5%至95% 的值。（b)顯示嚷嶺和喀晚的兩個不同能級的酸性條件下的RNA核巧酸的測量的能量帶隙的 箱形圖。（c-d)DNA和RNA上的相同核堿基的H0M0/LUM0能級的分布的比較，（C)脫氧腺巧與腺 巧的比較，（d)脫氧胞巧與胞巧的比較。
[0025] 圖8a至圖8e使用STM-STS進(jìn)行的單核巧酸修飾的鑒定。（a)酸性條件下的沉積在多 聚レ賴氨酸涂覆的Au(lll)基片上的利用硫酸二甲醋(DMS)處理的腺嚷嶺寡聚物的STM圖 像。郵鄰的核巧酸(如所顯示的）上的甲基化和未甲基化的腺嚷嶺的簡便鑒定突顯使用該新 的測序技術(shù)檢測單核巧酸修飾的潛能。(b)利用DMS的腺嚷嶺甲基化的反應(yīng)產(chǎn)物，（C)鳥嚷嶺 與DMS反應(yīng)產(chǎn)生7-甲基鳥嚷嶺及其具有開環(huán)的水解產(chǎn)物的反應(yīng)方案，（d)酸性條件下未甲基 化的（實(shí)線)和甲基化的腺嚷嶺的冊M0/LUM0能級的分布，（e)酸性條件下的鳥嚷嶺(實(shí)線）、 甲基化的鳥嚷嶺(點(diǎn)線)和開環(huán)甲基化的鳥嚷嶺(虛線）的冊M0/LUM0能級的分布。
[0026] 圖9a至圖9d使用QM-Seq進(jìn)行的單核巧酸修飾的鑒定。（a)利用DMS的胞喀晚甲基化 的反應(yīng)產(chǎn)物。（b)酸性條件下的未甲基化的（藍(lán)色)胞喀晚和甲基化的胞喀晚（紫色）的HOMO 和LUMO位置的箱形圖（25-75 %的四分位數(shù)）。細(xì)須顯示5 % -95 %的四分位數(shù)，中屯、線為中位 數(shù)。（c-d)未甲基化的胞喀晚(C)和甲基化的胞喀晚(d)的隧穿譜(I-V，虛曲線)和(dl/dV，實(shí) 曲線）。兩者具有相同的垂直軸（電壓）。重疊的藍(lán)色和紫色線可視地顯示關(guān)于每一個分布的 峰位置上的差異。
[0027] 圖10a至圖10b電子態(tài)(dl/dV)譜的I-V和密度的測量。（a)中性抑下的胞喀晚的的 STS電流(I)-電壓(V)曲線，（b)顯示峰位置化0M0和LUM0能級)及其能隙的其導(dǎo)數(shù)。其它圖中 顯示的隧穿特征為代表至少20個獨(dú)立的光譜學(xué)數(shù)據(jù)(針對各核堿基測量的）的系綜的概率 密度函數(shù)。對于I-V譜的每一個獨(dú)立測量，將導(dǎo)數(shù)dl/dV用于鑒定冊M0和LUM0能級W及能帶 系。隨后運(yùn)些用于產(chǎn)生代表來自HOMO和LUM0能級的能量位置和能量帶隙的正態(tài)分布的概率 密度函數(shù)。電子特征的多分散性可能由構(gòu)型賭或通過不同分子構(gòu)象(在室溫下由熱能支持 的）的電荷隧穿引起。
[0028] 圖11a至圖lid不同pH條件下具有它們各自的地a的核巧酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。從上至下， (a)腺嚷嶺(A)，（b)鳥嚷嶺(G)，（c)胞喀晚（C)和(d)胸巧（T)。胸巧在酸性條件下具有處于 9.9的單一地a，并且可經(jīng)歷締醇化和質(zhì)子化。
[0029] 圖12抑對鳥嚷嶺LUM0/冊M0能級的作用。酸性(利用0.1M肥1)、中性化2〇)和堿性 (0.1M化0H)pH下沉積在Au( 111)表面上的鳥嚷嶺的LUM0(正峰值)和冊M0(負(fù)峰值)能級的 分布。箭頭指示酸性、中性與堿性條件之間LUM0和冊M0能級的偏移。酸性(pH低于第一地a約 3.2-3.3)、中性和堿性條件(高于其第二地a約9.2-9.6)下的鳥嚷嶺的3個生化結(jié)構(gòu)。同分異 構(gòu)體中的空穴捕獲可能導(dǎo)致HOMO能級(更難通過隧道空穴)隨著抑升高(從酸性，至中性至 堿性條件)的穩(wěn)定升高。然而，酸性和堿性條件下的多個諧振結(jié)構(gòu)（圖11)導(dǎo)致相較于中性條 件的更容易的電子隧穿(和較低的LUM0能級）。此外，堿性條件下的進(jìn)一步的靜電排斥(歸因 于地曰2)增加了電子隧穿概率，并導(dǎo)致在堿性抑下LUM0能級的進(jìn)一步下降。
[0030] 圖13a至圖13e鳥嚷嶺的原始數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)：（a)酸性條件下的鳥嚷嶺的原始電流-電 壓(I-V)曲線。（b)(a)的原始譜或dl/dV，箭頭指示作為每一個譜上的第一顯著負(fù)/正峰值的 鑒定的H0M0/LUM0能級。（c-e)與數(shù)據(jù)集擬合的，與正態(tài)分布概率密度函數(shù)（由曲線指示的， 也示于圖4a、4b中的）重疊的鳥嚷嶺的H0M0(c)、LUM0(d)和能隙（e)的位置的直方圖。陰影箱 表示包含平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的曲線的面積。
[0031 ] 圖14抑對腺嚷嶺LUM0/冊M0能級的作用。在酸性（用0.1M HC1洗涂的）、中性化0) 和堿性(0.1M化0H)抑下沉積在Au (111)表面上的腺嚷嶺的LUM0 (正峰值)和HOMO (負(fù)峰值） 能級的分布。雖然腺嚷嶺在任何pH條件(帶電荷的和不帶電荷的）下具有多個諧振結(jié)構(gòu)，但 未觀察到抑對其隧穿概率的顯著作用（因諧振結(jié)構(gòu)之間的電荷的耗散）dH0M0能級隨抑的升 高的少量升高可歸功于酸性抑下的更容易的空穴隧穿（因正電荷而導(dǎo)致的）。
[0032] 圖15a至圖15e腺嚷嶺的原始數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)：（a)酸性條件下的腺嚷嶺的原始電流-電 壓(I-V)曲線。（b)(a)的dl/dV的原始譜，箭頭指示作為每一個譜上的第一顯著的負(fù)/正峰值 的鑒定的冊M0/LUM0能級。（c-e).與數(shù)據(jù)集擬合的，與正態(tài)分布概率密度函數(shù)（由曲線指示 的，也示于圖4a、4b中的）重疊的腺嚷嶺的H0M0(c)、LUM0(d)和能隙（e)的位置的直方圖。陰 影箱表示包含平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的曲線的面積。
[0033] 圖16抑對胞嚷嶺LUM0/冊M0能級的作用。在酸性（用0.1M HC1洗涂的）、中性化0) 和堿性(0.1M NaOH) pH下的沉積在Au (111)表面上的胞喀晚的L