一種用于誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子的混合多肽的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子的混合多肽。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病是一種常見的由結(jié)核分枝桿菌引起的慢性傳染病，可侵及許多臟器，以肺部結(jié)核感染最為常見。目前全球有近1/3的人已感染結(jié)核桿菌，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明在2013年有150萬人死于結(jié)核病，900萬新發(fā)病例，結(jié)核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。中國是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，活動(dòng)性肺結(jié)核病人數(shù)居世界第二位。結(jié)核病的傳染主要是發(fā)生在病人未被發(fā)現(xiàn)并進(jìn)行治療之前，I名結(jié)核病患者一年中通過密切接觸可傳染多達(dá)10-15人。結(jié)核病的傳播方式為經(jīng)呼吸道傳播，在肺結(jié)核病人的肺中有大量的結(jié)核桿菌，如果他對著健康人群咳嗽或打噴嚏的話就很有可能將病菌傳播給健康人。而在未發(fā)現(xiàn)病患前，病人未采取任何預(yù)防手段，在與家庭成員、同事、同學(xué)等密切接觸的過程中，接觸者就容易被結(jié)核菌感染?，F(xiàn)階段結(jié)核病的主要治療方法主為藥物治療，但是這樣的治療不能夠完全阻止結(jié)核病的傳播。接種卡介苗(BCG)是目前國際公認(rèn)的最有效預(yù)防結(jié)核病的免疫方法，中國的計(jì)劃免疫接種程序中規(guī)定新生兒須接種卡介苗，但是其保護(hù)效率也并未達(dá)到100%，因此，預(yù)防結(jié)核病的首要措施是盡早發(fā)現(xiàn)隱藏在人群中的新發(fā)病人。
[0003]結(jié)核分枝桿菌是一種典型的胞內(nèi)感染菌，人體對其免疫機(jī)制主要是以T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫。結(jié)核分枝桿菌侵入呼吸道后，原肺泡中未活化的樹突狀細(xì)胞(Dendriticcells，DC)抗菌活性弱，不能防止所吞.的結(jié)核分枝桿菌生長，但可將結(jié)核分枝桿菌吞.并帶到他處，提呈抗原，使周圍T淋巴細(xì)胞致敏，致敏的T淋巴細(xì)胞可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子(INF-γ、IL-2、IL-4與TNF-α等)，這些細(xì)胞因子共同作用，殺死病灶中的結(jié)核分枝桿菌。根據(jù)這一免疫機(jī)制，通過對已感染結(jié)核分枝桿菌的患者及健康人血液中的細(xì)胞因子進(jìn)行分析對比，發(fā)現(xiàn)感染結(jié)核分枝桿菌的患者其血液中INF- γ、IL-2、TNF-a的濃度明顯升高。
[0004]對于已經(jīng)感染了結(jié)核分支桿菌的患者，當(dāng)已經(jīng)免疫過的特異性淋巴細(xì)胞再次接觸結(jié)核桿菌時(shí)，仍然會(huì)分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子。為研究結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)制及免疫機(jī)制，研究人員使用體外誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子的方式。將已經(jīng)感染了結(jié)核分枝桿菌的患者的外周血采出，提取其中的PBMC，并采用結(jié)核相關(guān)抗原對其進(jìn)行刺激，PMBC中的T淋巴細(xì)胞即可對抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞因子。由于直接使用結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)具有相當(dāng)?shù)奈ｋU(xiǎn)性，不利于進(jìn)行大量研究，因此研究人員采用提取的結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白進(jìn)行研究實(shí)驗(yàn)。
[0005]結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)是從結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中獲得的活性物質(zhì)，可以刺激T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子，但對于已經(jīng)經(jīng)過卡介苗(BCG)免疫個(gè)體的樣本，Pro同樣能夠刺激其提取出來的τ細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子，因此pro的特異性較低，還需尋找特異性更好的刺激物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種用于誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子的混合多肽。
[0007]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種混合多肽，包括下列多肽序列:
Dmaemktdaatlaqeagnferis⑶Useq id no:d；
2)GNFERIS⑶LKTQIDQVESTAGSLQ(SEQID N0:2)；
3)QVESTAGSLQGQffRGAAGTAAQAAV(SEQID NO:3);
4)AAGTAAQAAVVRFQEAANKQKQELD(SEQID N0:4)；
5)ANKQKQELDEISTNIRQAGVQYSR(SEQID N0:5)；
6)IRQAGVQYSRADEEQQQALSSQMGFCSEQID N0:6)；
7)MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSI(SEQID N0:7)；
8)SAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLA(SEQID N0:8)；
9)EGKQSLTKLAAAffGGSGSEAYQGVQ(SEQID N0:9)；
10)SGSEAYQGVQQKffDATATELNNALQ(SEQID NO:10)；
11)TATELNNALQNLARTISEAGQAMAS(SEQID NO:11);
12)1SEAGQAMASTEGNVTGMFA(SEQID NO:12)；
13)LAALAAVVELGSFDAAAERLHVTPS(SEQID NO:13)；
14)AAAERLHVTPSAVSQRIKSLEQQVG(SEQID NO:14)；
15)RIKSLEQQVGQVLVVREKPCRATTA(SEQID NO:15)；
16)REKPCRATTAGIPLLRLAAQTALLE(SEQID NO:16)；
17)RLAAQTALLESEALAEMGGNASLKRCSEQID NO:17)；
18)MGGNASLKRTRITIAVNADSMATWF(SEQID NO:18)。
[0008]優(yōu)選的，上述混合多肽是由以下氨基酸序列編碼: Datggcagagatgaagaccgatgccgctaccctcgcgcaggaggcaggtaatttcgagcggatctccggcga
CCTGCSEQ ID NO:19)；
2)GGTAATTTCGAGCGGATCTCCGGCGACCTGAAAACCCAGATCGACCAGGTGGAGTCGACGGCAGGTTCGTTGCAGCSEQ ID NO:20)；
3)CAGGTGGAGTCGACGGCAGGTTCGTTGCAGGGCCAGTGGCGCGGCGCGGCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGCSEQ ID NO:21);
4)GCGGGGACGGCCGCCCAGGCCGCGGTGGTGCGCTTCCAAGAAGCAGCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTCGACGAGCSEQ ID NO:22)；
5)GCCAATAAGCAGAAGCAGGAACTCGACGAGATCTCGACGAATATTCGTCAGGCCGGCGTCCAATACTCGAGGGCCCSEQ ID NO:23)；
6)CGTCAGGCCGGCGTCCAATACTCGAGGGCCGACGAGGAGCAGCAGCAGGCGCTGTCCTCGCAAATGGGCTTCCSEQ ID NO:24)；
7)AGCATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTCGCGGGTATCGAGGCCGCGGCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCCSEQ ID NO:25)；8)GCAAGCGCAATCCAGGGAAATGTCACGTCCATTCATTCCCTCCTTGACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCCSEQ ID NO:26)；
9)GACGAGGGGAAGCAGTCCCTGACCAAGCTCGCAGCGGCCTGGGGCGGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCSEQ ID NO:27)；
10)GGTAGCGGTTCGGAGGCGTACCAGGGTGTCCAGCAAAAATGGGACGCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCSEQ ID NO:28)；
11)GCCACGGCTACCGAGCTGAACAACGCGCTGCAGAACCTGGCGCGGACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTCSEQ ID NO:29)；
12)ACGATCAGCGAAGCCGGTCAGGCAATGGCTTCGACCGAAGGCAACGTCACTGGGATGTTCGCATAG(SEQID NO:30)；
13)CTGGCCGCATTGGCTGCCGTGGTCGAACTGGGCAGCTTCGATGCGGCCGCGGAGCGCCTACATGTCACCCCGTCGCSEQ ID NO:31);
14)GCCGCGGAGCGCCTACATGTCACCCCGTCGGCTGTCAGTCAGCGCATCAAGTCGTTGGAGCAGCAGGTCGGCCAGCSEQ ID NO:32)；
15)ATCAAGTCGTTGGAGCAGCAGGTCGGCCAGGTGCTGGTGGTCAGGGAAAAGCCATGTCGGGCGACGACCGCAGGTCSEQ ID NO:33)；
16)GAAAAGCCATGTCGGGCGACGACCGCAGGTATCCCGCTGTTGCGGTTGGCCGCGCAAACAGCGTTGCTCGAGTCCCSEQ ID NO:34)；
17)TTGGCCGCGCAAACAGCGTTGCTCGAGTCCGAGGCGCTCGCTGAAATGGGTGGCAACGCGTCGCTGAAACGCACGCSEQ ID NO:35)；
18)ATGGGTGGCAACGCGTCGCTGAAACGCACGCGGATCACCATTGCGGTAAACGCCGATTCCATGGCGACATGGTTTCSEQ ID NO:36)。
[0009]優(yōu)選的，所述混合多肽作為誘導(dǎo)外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子誘導(dǎo)劑的應(yīng)用。
[0010]優(yōu)選的，所述混合多肽作為結(jié)核病檢測抗原的應(yīng)用。
[0011 ]優(yōu)選的，所述混合多肽作為結(jié)核病預(yù)防治療刺激物的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明提供了一種可以刺激效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的混合多肽。本發(fā)明通過生物信息學(xué)方法結(jié)合抗原表位預(yù)測，篩選出很多條長度均一的多肽，并使用該混合多肽對已感染結(jié)核分枝桿菌的人群的T細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，檢測分泌的結(jié)核相關(guān)細(xì)胞因子，該方法與常用的刺激蛋白CFP-10、ESAT-6及Rvl985c蛋白或三種蛋白的混合物相比，其誘導(dǎo)性能更高效、特異性更好。
[0013]本發(fā)明的混合多肽敏感性強(qiáng)、特異性高，只與結(jié)核桿菌感染人體后產(chǎn)的免疫記憶T細(xì)胞起反應(yīng)，產(chǎn)生的細(xì)胞因子是結(jié)核桿菌抗原特異性的IFN-γ、IL-2、TNF-a等結(jié)核相關(guān)因子，同時(shí)這一刺激反應(yīng)不受BCG的干擾。
[0014]本發(fā)明提供的特異性抗原蛋白刺激效果好，刺激抗原采用混合多肽的形式，較短的氨基酸序列更易被淋巴細(xì)胞表面的抗原表位識(shí)別，從而達(dá)到刺激細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子的作用。
[0015]本發(fā)明提供的特異性抗原對結(jié)核病致病及免疫預(yù)防機(jī)制的研究有重要意義，從而對結(jié)核病的控制具有積極的意義。
【附圖說明】
[0016]圖1為不同來源的PBMC經(jīng)混合多肽刺激后IL-2分泌水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；
圖2為不同來源的PBMC經(jīng)混合多肽刺激后IFN- γ分泌水平ELISP0T檢測結(jié)果圖；
圖3為不同來源的PBMC經(jīng)混合多肽刺激后TNF-α分泌水平統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；
圖4為不同刺激抗原對PBMC刺激效果對比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
[0018]實(shí)施例1、特異性混合多肽的抗原表位分析及多肽合成
參照GenBank數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對抗原表位進(jìn)行分析預(yù)測，優(yōu)選出混合多肽(SEQ ID NO:1?18)，其中每條多肽含20-25個(gè)氨基酸，相鄰兩條多肽之間含有8-10個(gè)氨基酸重復(fù)序列?；旌媳壤龥]有硬性規(guī)定，優(yōu)選的，18條多肽為等質(zhì)量混合。
[0019]進(jìn)一步根據(jù)計(jì)算得到氨基酸序列:其中混合多肽SEQID Ν0:1?18分別由核苷酸序列SEQ ID NO: 19?36編碼。采用多肽固相合成法(SPPS)，按照合成儀說明書進(jìn)行操作生成所需多肽，并將產(chǎn)物進(jìn)行凍干處理以備用。
[0020]
實(shí)施例2、密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)
使用新鮮肝素鋰或肝素鈉的采血管或真空采血管無