半滑舌鰨補(bǔ)體成分C5a的重組蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說是半滑舌鰨補(bǔ)體成分C5a(CsC5a)的重組蛋 白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 補(bǔ)體因子5(Complement factor 5，C5)是補(bǔ)體系統(tǒng)的一個(gè)成分。人類C5蛋白由α、β 兩條多肽鏈通過二硫鍵組成，分子量為190kDa<X5靠近N端的第74-75位精氨酸-亮氨酸鍵為 C5轉(zhuǎn)化酶作用的部位。補(bǔ)體系統(tǒng)通過三條途徑(經(jīng)典途徑、旁路途徑和凝集素途徑)激活后， 均生成C5轉(zhuǎn)化酶。C5蛋白在C5轉(zhuǎn)化酶的作用下裂解為C5a和C5b兩個(gè)片段。C5a是C5的α鏈的N 端約S-IOkD的肽段，是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)和趨化因子。C5a通過與細(xì)胞表面的C5a受體結(jié) 合而激活相應(yīng)的信號(hào)通路，刺激白細(xì)胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)、趨化效應(yīng)等炎癥反應(yīng)，從而輔助激活 機(jī)體的先天性免疫，促進(jìn)獲得性免疫應(yīng)答。目前，C5和C5a已經(jīng)在虹鱒和鯉魚等魚類中報(bào)道， 但是它們?cè)隰~類中的應(yīng)用性研究尚缺乏。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明目的在于提供一種半滑舌鰨補(bǔ)體成分C5a的重組蛋白及其應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] -種半滑舌鰨補(bǔ)體成分C5a的重組蛋白，半滑舌鰨補(bǔ)體成分C5a的重組蛋白以半滑 舌鰨cDNA為模板，用引物C5F1和C5R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增補(bǔ)體成分CsC5a基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)誘導(dǎo)表 達(dá)、純化即為重組蛋白，所述C5F1 為5 ' -GATATCATGGAGAAGAGGATAAAAGCGGCA-3 ' ； C5R1 為5 ' -GATATCGCCGAGGACGAGGGTTTCCTCT-3 '。
[0006] -種半滑舌鰨補(bǔ)體成分C5a的重組蛋白的應(yīng)用，所述半滑舌鰨補(bǔ)體成分C5a的重組 蛋白可用于制備增強(qiáng)外周血淋巴細(xì)胞的吞噬作用的制劑。
[0007] -種半滑舌鰨補(bǔ)體成分C5a的重組蛋白的應(yīng)用，所述半滑舌鰨補(bǔ)體成分C5a的重組 蛋白可用于制備抑制細(xì)菌或病毒感染的制劑。
[0008] 細(xì)菌為哈氏弧菌，是魚類常見的致病性細(xì)菌，能感染多種養(yǎng)殖魚類包括牙鲆、大菱 鲆、半滑舌鰨等。
[0009] 病毒為細(xì)胞腫大病毒，是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)殖魚類的病毒，能感染大菱鲆、條石鯛、 半滑舌鰨等。
[0010] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明的補(bǔ)體成分C5a重組蛋白，能夠顯著提高外周血淋巴 細(xì)胞的吞噬能力和增強(qiáng)魚類的抗細(xì)菌及抗病毒能力。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的重組補(bǔ)體成分C5a(命名為rCsC5a)電泳圖。泳道1，分子 量標(biāo)準(zhǔn);泳道2，補(bǔ)體成分rCsC5a。
[0012] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的重組補(bǔ)體成分rCsC5a的促吞噬作用。A，半滑舌鰨外周 血淋巴細(xì)胞（peripheral blood leukocytes，PBL) qE^PBL+FITC-標(biāo)記的哈氏弧菌。C，PBL+ FITC-標(biāo)記的哈氏弧菌+rCsC5a。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。
[0014] 在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法：
[0015] 1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收皆使用"天根生化科技(北 京)有限公司"的相應(yīng)試劑盒。
[0016] 2 ·大腸桿菌用Hanahan方法（Sambrook and Russel 1:Molecular Cloning : A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)〇
[0017] 3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于"紐英倫生物技術(shù)有限公司"，北京。
[0018] 實(shí)施例1
[0019] 補(bǔ)體成分C5a重組蛋白rCsC5a的制備
[0020] 1)表達(dá)補(bǔ)體成分C5a重組蛋白rCsC5a的質(zhì)粒pCsC5a的構(gòu)建：
[0021] 本發(fā)明的補(bǔ)體成分rCsC5a為半滑舌鰨補(bǔ)體成分C5的一部分(氨基酸685-751)，C5 序列已公布（GenBank accession number ΧΡ_008334663· 1)〇 [0022] CsC5a由67個(gè)氨基酸組成，具有典型的anaphylatoxin結(jié)構(gòu)。
[0023]以半滑舌鰨cDNA為模板，用引物C5F1和C5R1進(jìn)行PCR擴(kuò)增補(bǔ)CsC5a基因。PCR條件 為：94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s，62°C 60s，72°C 658,30個(gè)循環(huán)后再在72°(3延 伸反應(yīng)7 - IOmin JCR產(chǎn)物用天根的相應(yīng)試劑盒純化。將表達(dá)載體pET259(構(gòu)建過程參見Hu YH,Zheng Wff,Sun L.Identification and molecular analysis of a ferritin subunit from red drum(Sciaenops ocellatus) .Fish Shellfish Tmmunol 2010;28:678-86)用限 制性內(nèi)切酶EcoRV酶切后回收5.3kb片段，將其與上述純化的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接， 連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，在含卡那霉素（l〇〇ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，篩 選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，命名為pCsC5a。通過DNA測(cè)序分析證明了 pCsC5a為含有上述C5結(jié)構(gòu)域的 補(bǔ)體成分CsC5a序列的表達(dá)質(zhì)粒。
[0024]所述LB組成成分按重量百分比計(jì)：1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉， 97 · 5 % 蒸餾水。所述C5F1 為5 ' -GATATCATGGAGAAGAGGATAAAAGCGGCA-3 ' ； C5R1 為5 ' -GATATCGCCGAGGACGAGGGTTTCCTCT-3 '。
[0025] 2)rCsC5a的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
[0026]將上述的質(zhì)粒pCsC5a用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(購自于"天根生化科技 有限公司"，北京），在含有卡那霉素（50ug/ml)的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 -24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn) 化子，將其命名為BL21/pCsC5a。將BL21/pCsC5a于含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基 中過夜培養(yǎng);取Iml過夜后的培養(yǎng)液，加入IOOrnl新鮮的含有卡那霉素(50ug/ml)的LB液體培 養(yǎng)基中，于37°C下轉(zhuǎn)速200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)至OD 6qq為0.6，加入終濃度為ImM的IPTG，16°C繼續(xù)以 轉(zhuǎn)速160rpm搖動(dòng)培養(yǎng)16h，而后以5000g，4°C離心I Omin，收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫 于搖床上緩慢搖動(dòng)1-2小時(shí)，直至菌懸液變澄清為止。將菌液以10000g，4°C離心30min，回收 上清。將上清中的蛋白用親和層析柱His Trap HP Columns(購于美國(guó)GE Healthcare公司） 回收純化。將純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)(8v/cm電壓下電泳25 - 30min，隨后15v/cm電 壓下電泳2 - 2.5h)，測(cè)定其分子量大?。▍⒁妶D1)。發(fā)現(xiàn)rCsC5a的蛋白質(zhì)質(zhì)量與補(bǔ)體成分 CsC5a相同。
[0027] 所述裂解液為終濃度的IOmM NaH2P〇4、