一種淋巴因子tal及其編碼基因和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于應用海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種淋巴因子TAL及其編碼基因和 應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 香港牡(Crassostrea hongkongensis)主要分布在我國華南沿海眾多的河口地 帶，也是廣東省沿海養(yǎng)殖最廣泛貝類，有著個體大、味道美、營養(yǎng)豐富、具有食補功能等特 點，深受廣大消費者喜愛，年養(yǎng)殖產(chǎn)量已達70多萬噸，年產(chǎn)值約25-30億元，是華南沿海海水 養(yǎng)殖支柱產(chǎn)業(yè)之一。但是，近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，養(yǎng)殖環(huán)境的破壞，以及病害的 頻發(fā)，使得香港牡蠣出現(xiàn)了大規(guī)模死亡，嚴重制約了香港牡蠣養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。
[0003] 貝類血淋巴細胞是貝類免疫防御系統(tǒng)的核心和最重要的器官，通過參與細胞凝 集、吞噬作用、呼吸爆發(fā)和包囊化等過程起到免疫防御的作用。由于淋巴細胞生命短暫，貝 類生長發(fā)育過程中一直伴隨著淋巴細胞的發(fā)生和分化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種新的能促進牡蠣血淋巴細胞增殖的淋巴因子TAL及其編 碼基因和應用。
[0005] 本發(fā)明的淋巴因子TAL，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0006] 本發(fā)明還提供一種編碼上述淋巴因子TAL的淋巴因子TAL基因。
[0007]優(yōu)選，所述的淋巴因子TAL基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本發(fā)明還提供一種含有淋巴因子TAL基因的原核表達載體。優(yōu)選，所述的原核表達 載體為pET_28a表達載體。
[0009] 本發(fā)明還提供一種含有包含淋巴因子TAL基因的原核表達載體的細菌。優(yōu)選，所述 的細菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0010] 本發(fā)明還提供淋巴因子TAL在促進貝類血淋巴細胞增殖中的應用。
[0011] 所述的應用，優(yōu)選包含將淋巴因子TAL注射到貝類閉殼肌的步驟。
[0012] 所述的貝類優(yōu)選為香港牡(Crassostrea hongkongensis) 〇
[0013] 本發(fā)明通過篩選香港牡蠣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，首次從香港牡蠣中分離一種淋巴因子 TAL，其基因全長660bp，編碼219個氨基酸;通過功能分析和鑒定，發(fā)現(xiàn)香港牡蠣的淋巴因子 TAL可以促進血淋巴細胞的增殖，是一種新型的淋巴細胞生長因子。本發(fā)明中的淋巴因子 TAL具有顯著的促進血淋巴細胞增殖作用，為貝類的病害防治和抗病育種提供了重要的理 論與實踐依據(jù)。
【附圖說明】
[0014]圖1是純化的淋巴因子TAL重組蛋白。M為蛋白Marker; 1為未誘導表達的蛋白；2為 IPTG誘導后表達的蛋白；3為純化后的淋巴因子TAL重組蛋白。
[0015] 圖2是淋巴因子TAL重組蛋白促進血淋巴細胞增殖的EdU增殖結(jié)果。ChTAL為淋巴因 子TAL重組蛋白組，BSA為對照組;Edu顯示的是新增殖的血淋巴細胞，DAPI顯示的是活的血 淋巴細胞，Merge是Edu和DAPI像的融合。
【具體實施方式】
[0016] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0017] 實施例1:
[0018] I. RNA 提取
[0019] 香港牡總RNA的提取使用TriZOl(Invitorgen)提取，具體步驟如下：（1)取50mg 香港牡蠣組織于液氮預冷的研缽中，將組織磨成粉末之后，轉(zhuǎn)移到裝有Iml Trizol的離心 管中，吹打、混勻；（2)加入200yL氯仿，劇烈震蕩40s，室溫放置511^11;(3)4°(3，12,000\8離心 IOmin，吸取上清轉(zhuǎn)移至新管；（4)加入0.5ml的異丙醇，混勻，-80°C沉淀過夜；（5)4°C，12， OOOXg離心10min，棄上清；（6)75%乙醇清洗兩次沉淀；（7)棄上清，加入50yL DEPC水溶解 RNA0
[0020] 2.CDNA文庫構(gòu)建
[0021] 全長cDNA文庫構(gòu)建使用GeneRacer? cDNA library construction Kit (Invitrogen)，其中5'RACE具體步驟如下：（1)牛腸磷酸酶(CIP)除去RNA的5'磷酸，用煙草 酸焦磷酸酶(TAP)去除，脫掉5 '磷酸基團RNA的5 '帽子結(jié)構(gòu)；（2)用T4RNA連接酶將特異的一 段RNAOligo鏈接到RNA的5 '端；（3)用隨機引物反轉(zhuǎn)錄生成5 'RACE第一條鏈;3 'RACE具體步 驟如下：用試劑盒提供的GeneRacer?01igo dT Primer為引物直接反轉(zhuǎn)錄生成第一條鏈;最 后檢測cDNA文庫滴度。
[0022] 3.原核表達載體構(gòu)建
[0023] (1)根據(jù)香港牡蠣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到的序列信息，設(shè)計一對包含香港牡蠣淋 巴因子TAL基因的 ORF 的特異性引物（ChTa I-F: ATGCGGATCCATGTCGACGGAGTATAGAAG; ChTal-R:ACTGCTCGAGTTACGCTGAATGCAGACTTT)，在引物兩端分別添加 BamH I和Xho I酶切位點；（2) 使用這對引物，以構(gòu)建好的cDNA文庫為模板，PCR擴增出香港牡蠣淋巴因子TAL基因的ORF (其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）；（3)PCR產(chǎn)物和pET-28a載體分別使用BamH-I和Xho-I 內(nèi)切酶進行雙酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳純化酶切產(chǎn)物并回收；（4)將純化后的酶切PCR產(chǎn) 物和酶切pET_28a載體連接；（5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆， 測序驗證載體正確無誤，測序結(jié)果表明如SEQ ID NO. 1所示的序列（淋巴因子TAL基因，共 660bp)插入了pET-28a載體中，由此得到含有淋巴因子TAL基因的pET-28a載體，進行后續(xù)原 核表達實驗。淋巴因子TAL基因編碼的淋巴因子TAL的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，含有 219個氨基酸。
[0024] 4.重組蛋白的原核表達和純化
[0025] (1)提取步驟3的含有淋巴因子TAL基因的pET-28a載體，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3);(2)挑選單克隆并培養(yǎng)至0D = 0.6，加入IPTG至終濃度為0.1mM，37°C，200rpm的條件 下誘導表達；（3)4h后收集菌液，4°C，12，000Xg離心10min; (4)加入Lysozyme至終濃度2mg/ ml，冰浴下超聲2-3個循環(huán)(超聲4s，間歇4s，重復90次為一個循環(huán))破碎細菌細胞；（5)使用 Ni-NTA純化重組蛋白，在12 % SDS-PAGE膠分析純化產(chǎn)物。其蛋白電泳結(jié)果如圖1所示，大小 與理論值相符合，由此得到淋巴因子TAL重組蛋白。
[0026] 5.血淋巴細胞EdU增殖測定
[0027] 分別將I OOyL (100mg/ml)香港牡蠣淋巴因子TAL重組蛋白和I OOyL (100mg/ml) BSA 注射到香港牡蠣閉殼肌，其中BSA作為對照組；12h后每個組隨機取10只香港牡蠣。利用EdU 標記技術(shù)檢測血淋巴細胞的增殖。具體步驟如下：（1)從上述隨機抽取的香港牡蠣中取出血 淋巴細胞以每孔1106接種于6孔板中；（2)在每孔中加入IOum的EdU，室溫避光孵育2小時； (3)PBS清洗細胞2次，每次3分鐘；（4)加入ImL 4%的多聚甲醛室溫孵育10分鐘；（5)PBS清洗 細胞2次，每次3分鐘；（6)加入ImL含0.5%TritonX-ΙΟΟ的PBS室溫孵育10分鐘，然后I 3BS清洗 細胞2次；（7)加入500uLClick-iT?反應液室溫避光孵育30分鐘；（8)棄Click-iT?反應液， 用含有3%的BSA的PBS清洗細胞；（9)加入500uL稀釋的DAPI試劑，室溫避光孵育10分鐘，然 后棄染色液，用PBS清洗三次；（10)熒光顯微鏡下鏡檢觀察。結(jié)果如圖2所示，注射淋巴因子 TAL重組蛋白組比注射BSA組的新增殖的血淋巴細胞數(shù)量明顯要多，結(jié)果表明淋巴因子TAL 重組蛋白能顯著的促進血淋巴細胞增殖。
【主權(quán)項】
1. 一種淋巴因子TAL，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的淋巴因子TAL的淋巴因子TAL基因。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的淋巴因子TAL基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。4. 一種含有權(quán)利要求2所述的淋巴因子TAL基因的原核表達載體。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的原核表達載體，其特征在于，所述的原核表達載體為pET-28a 表達載體。6. -種含有權(quán)利要求4所述的原核表達載體的細菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的細菌，其特征在于，所述的細菌為大腸桿菌BL21 (DE3)。8. 權(quán)利要求1所述的淋巴因子TAL在促進貝類血淋巴細胞增殖中的應用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于，包含將淋巴因子TAL注射到貝類閉殼肌的 步驟。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應用，其特征在于，所述的貝類為香港牡(Crassostrea hongkongensis)〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種淋巴因子TAL及其編碼基因和應用。本發(fā)明首次從香港牡蠣中分離一種淋巴因子TAL，其編碼基因全長660bp，編碼219個氨基酸；通過功能分析和鑒定，發(fā)現(xiàn)香港牡蠣的淋巴因子TAL可以促進血淋巴細胞的增殖，是一種新型的淋巴細胞生長因子。本發(fā)明中的淋巴因子TAL具有顯著的促進血淋巴細胞增殖作用，為貝類的病害防治和抗病育種提供了重要的理論與實踐依據(jù)。
【IPC分類】C12N15/19, C12N15/70, A61P37/02, C12N1/21, C07K14/52, C12R1/19, A61K38/19
【公開號】CN105541995
【申請?zhí)枴緾N201610024181
【發(fā)明人】李軍, 張揚, 喻子牛, 劉映, 張躍環(huán)
【申請人】中國科學院南海海洋研究所
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月13日