一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝的制作方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種從人血漿冷沉淀提取凝血因子珊的廢料中提取人血管性血友病因子的制備工藝，特別涉及一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝，屬于生物制藥領(lǐng)域?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]VWF是一種具有多聚體的血漿糖蛋白，其分子量從250kDa到2千萬(wàn)kDa不等，形成血漿中已知的最大分子量可溶性蛋白。血漿中小分子量vWF主要是二聚體形式，分子量約500kDa。大小不等的多聚體，對(duì)維持vWF正常生物活性具有重要意義。[0003]血漿vWF在原發(fā)性止血中起著重要作用，其負(fù)責(zé)血小板與受損傷血管表面的粘附，并因此形成血小板栓子，有助于纖維蛋白交聯(lián)的形成。另外，血漿vWF起著凝血因子VIII的運(yùn)輸劑和穩(wěn)定劑的作用。[0004]血管性血友?。╲WD)是最常見(jiàn)的遺傳性出血性疾病，患者vonWillebrand因子(vonWillebrandfactor，vWF)基因突變或調(diào)控異常導(dǎo)致血漿vWF數(shù)量減少或質(zhì)量異常。vWD臨床特征主要為皮膚黏膜出血，2N型和3型患者還可發(fā)生與血友病A相似的關(guān)節(jié)腔出血和肌肉血腫。據(jù)國(guó)外報(bào)道，vWD發(fā)病率(2.3~11.0)/10萬(wàn)人口，一般認(rèn)為在遺傳性出血性疾病中，vWD居第二位。[0005]臨床上vWF的活性用瑞斯托霉素輔因子活性(vWF:RC〇)來(lái)表征，主要用于治療先天性、獲得性血管性血友病(vWD)，一般以20~60UvWF:RCo/kg劑量來(lái)給藥。[0006]研究表明冷沉淀中富含vWF等凝血因子類物質(zhì)。在血漿原料日趨緊缺的今天，通過(guò)冷沉淀來(lái)制備vWF，對(duì)冷沉淀的綜合利用，節(jié)約稀缺血漿資源，提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力具有重大意義。[0007]現(xiàn)有技術(shù)中，較早的工藝使用vWF的抗體偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠上，通過(guò)免疫親和層析純化vWF，但其抗體制備周期長(zhǎng)，凝膠載量低，不適合作大規(guī)模制備，如《PurificationofvonWiIlebrandFactorsolutionsusinggelpermeationchromatography》（UP4774323)〇[0008]有專利用DEAEFractogelTSK650M(Merck)純化vWF因子組分，純度高，但是工藝比較復(fù)雜，需要兩步離子交換和一步親和層析，如《Processforanindustrial-scalepreparationofastandardizedhumanvonWillebrandfactorconcentrateofveryhighpurityandsuitablefortherapeuticuse》（US5408039)。也有報(bào)道CHT層析結(jié)合PH5.4酸沉淀分離vWF組分的，其比活不高，且酸沉淀去除纖維結(jié)合蛋白的同時(shí)，可能影響vWF的生物學(xué)活性，如《Productionofavonwillebrandfactorprepartionhavingagreatspecificactivity))(US20070135619A1)〇[0009]另外還有一些工藝用EMDFractogelTMAE(Merck)來(lái)純化VIII/vWF因子復(fù)合物，但是都無(wú)法單獨(dú)得到高純度的vWF，治療針對(duì)性不強(qiáng)，如《具有止血活性的含有vWF的制劑及其制備方法》（CN1425024A)，《AProcessforrecoveringahigh-purityvirus-inactivatedfactorVIIIbyanionexchangerchromatography))(US5714590)。[0010]還有一些公司用基因重組的方法(猴腎細(xì)胞或CHO細(xì)胞)純化vWF，他通過(guò)陰離子交換層析法從動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行提純，但是由于動(dòng)物原性抗原的存在，人體對(duì)其可能有排斥作用，如《MethodforisolationofhighlypurevonWillebrandFactorKUS5854403)。[0011]另有采用兩步層析法純化制備vWF的報(bào)道，但其純度不高，比活相對(duì)較低，僅50IU/mg，如〈〈ProcessformanufacturingvonWiIlebrandfactor))(US5252710)〇[0012]可見(jiàn)，現(xiàn)有的的vWF純化工藝仍存在一些問(wèn)題：（I)制備周期長(zhǎng)，不適應(yīng)于大規(guī)模制備，尤其是采用免疫親和層析法純化時(shí)，其抗體制備周期長(zhǎng)，凝膠載量低。（2)VIII/vWF復(fù)合物產(chǎn)品在較難控制工藝穩(wěn)定性；（3)重組方法所得vWF產(chǎn)品可能存在異質(zhì)抗原；（4)分離純化工藝繁瑣。[0013]目前，血管性血友病可用冷沉淀、VIII/VWF因子復(fù)合物和DDAVPd-去氨基-8-D-精氨酸加壓素)治療，但針對(duì)性不強(qiáng)，更純的vWF因子可專一性治療各種類型的血管性血友病，與前幾種方法比有較大優(yōu)勢(shì)?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0014]本發(fā)明的目的在于提供一種高純度和高活性血管性血友病因子的制備工藝。[0015]本發(fā)明的主要技術(shù)構(gòu)思如下：[0016]本發(fā)明對(duì)經(jīng)層析后的蛋白液在層析緩沖液中加入甘氨酸保護(hù)vWF活性;優(yōu)選層析后凍干前的蛋白液中加入賴氨酸、甘氨酸和白蛋白作為凍干保護(hù)劑，保護(hù)vWF活性;優(yōu)選層析緩沖液中甘氨酸質(zhì)量濃度0.6%~1%，凍干保護(hù)劑中賴氨酸質(zhì)量濃度2~3%，甘氨酸質(zhì)量濃度0.2%，白蛋白質(zhì)量濃度0.8~1.3%。[0017]本發(fā)明于S/D病毒滅活前優(yōu)化添加2%氫氧化鋁凝膠進(jìn)行吸附去除11，11、^、乂因子;S/D滅活前串聯(lián)過(guò)濾使用的濾芯尺寸為1.Ομπι和0.45μηι的濾芯。[0018]本發(fā)明用一步Q-Sepharose陰離子交換層析及一步親和層析純化得到純度較高的vWF。即收集冷沉淀提取凝血因子VI的廢料即在冷沉淀提取凝血因子VI的制備中經(jīng)層析柱流出來(lái)的液體作為原料;通過(guò)Q-Sepharose離子交換柱層析后，收集洗脫液，再經(jīng)明膠親和層析，去除殘余的纖維結(jié)合蛋白及雜質(zhì)，得到血管性血友病因子。[0019]本發(fā)明的制備工藝中：[0020](1)通過(guò)調(diào)整洗滌緩沖液B和洗脫緩沖液B中的鹽濃度;采用Q-Sepharose柱層析法去除纖維蛋白原和纖維結(jié)合蛋白及其它雜蛋白；[0021](2)經(jīng)Q-Sepharose柱層析后的洗脫液，再經(jīng)明膠層析，通過(guò)調(diào)整洗脫緩沖液B和透析液的鹽濃度，去除殘余的纖維結(jié)合蛋白及雜質(zhì)，即得含高純度vWF的流穿液。[0022]本發(fā)明的制備工藝，它依次包括:冷沉淀溶解、2%氫氧化鋁凝膠吸附、調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度、串聯(lián)過(guò)濾、S/D病毒滅活、離子交換層析;離子交換層析得收集洗脫液，洗脫液經(jīng)超濾、透析、過(guò)濾，用于凝血因子VIII的生產(chǎn)，再?gòu)睦涑恋硖崛∧蜃覸I的廢料即收集經(jīng)層析柱流穿出的液體中提取vWF;Q-Sepharose陰離子交換層析、明膠親和層析、除菌過(guò)濾分裝、冷凍干燥、干熱滅活。離子交換層析流穿液收集后，先濃縮一倍，再用洗滌緩沖液B等體積超濾6次，再經(jīng)Q-Sepharose層析柱，用洗脫緩沖液B收集洗脫下來(lái)的蛋白液。[0023]本發(fā)明是這樣來(lái)實(shí)現(xiàn)的，其具體工藝方案如下：[0024](1)檢疫期檢疫合格的人血漿領(lǐng)取后，75%乙醇擦拭血漿袋表面，用注射用水沖洗，合并到融漿罐中，用30~35°C以下循環(huán)水融化，血漿溫度控制不高于4°C;待融化后，離心，出液溫度控制在0~4°C，收集冷沉淀；[0025](2)將步驟（1)的制得物加入3IU/ml肝素鈉溶液中，攪拌至冷沉淀完全溶解，循環(huán)水的溫度控制在28~37°C;開(kāi)始離心，收集上清液，稱重；[0026](3)將步驟(2)的制得物上清液用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)PH至6.0~7.0;加入2%氫氧化鋁凝膠，攪拌;開(kāi)始離心，收集上清液，稱重；[0027](4)按"W(離子強(qiáng)度緩沖液）=上清液重量/10"計(jì)算，稱取計(jì)算量的離子強(qiáng)度緩沖液至步驟(3)的制得物上清液中；調(diào)節(jié)上清液PH至6.0~7.0;用蛋白濃度緩沖液調(diào)節(jié)蛋白濃度不大于l〇g/L;用1.Ομπι的濾芯過(guò)濾，收集過(guò)濾液，稱重；[0028](5)按步驟(4)的制當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3