一株來自白花丹參植物內(nèi)生真菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一株來自白花丹參植物內(nèi)生真菌及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 木質(zhì)纖維素是地球上最為豐富的可再生生物質(zhì)資源。我國木質(zhì)纖維素類資源非常 豐富，賴桿、稻草、甘薦渣、動物糞便等農(nóng)業(yè)廢棄物中含有大量的纖維素和木質(zhì)素，但是運些 資源并沒有被合理利用，而是被焚燒或者被隨意丟棄。隨著環(huán)境污染、能源虧缺、人口膨脹 等問題日趨嚴重，可作為一種潛在的可再生資源被加 W利用，因此，國內(nèi)外學(xué)者對木質(zhì)纖維 素降解微生物進行了大量研究，但運些微生物處理后纖維素的降解率仍然不高，主要原因 是木質(zhì)素的側(cè)鏈與半纖維素 W共價鍵結(jié)合，形成一個十分致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，阻礙了微生物 對纖維素的降解。因此，要提高木質(zhì)纖維素利用率，最好的方法是先降解木質(zhì)素，其中漆酶 是快速檢測木質(zhì)素分解程度的重要指標，而后再對纖維素、半纖維素進行徹底降解。因此， 本專利的目的是尋找能高效降解木質(zhì)素和纖維素的微生物菌株，用于提高賴桿等木質(zhì)纖維 素的利用率。
[0003] 植物內(nèi)生真菌(Plant endophytic化ngi)是指那些在其生活史的一定階段或全 部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細胞間隙的真菌。內(nèi)生真菌在長期與植物共 生的過程中，與木質(zhì)纖維緊密接觸，具有較高的纖維素酶、漆酶、果膠酶、木聚糖酶W及多酪 氧化酶活性，對木質(zhì)素和纖維素有很好的降解能力，為篩選木質(zhì)纖維素降解菌提供了一個 良好的菌種來源。目前采用單一菌株發(fā)酵生產(chǎn)選木質(zhì)纖維素復(fù)合降解酶報道的較少，且現(xiàn) 有菌種所產(chǎn)的復(fù)合酶酶活較低，組成酶系也較單一，不能滿足需要生產(chǎn)的需要。至今尚未見 從白花丹參內(nèi)生真菌中篩選復(fù)合酶高產(chǎn)菌株的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一株來自白花丹參植物內(nèi)生真菌及其 應(yīng)用，該菌株在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，產(chǎn)生豐富的木質(zhì)纖維素復(fù)合降解酶。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 一株來自白花丹參植物內(nèi)生真菌，其為白黃小脆柄茹（Psathyrella candolleana)抓F15,已于2015年11月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中屯、(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏號為CGMCC No. 11415。
[0007] 一種菌劑，其活性成分為上述的白黃小脆柄茹（Psathyrella candolleana) 抓 FI 5。
[000引優(yōu)選:上述菌劑為下述(1)-(4)任一菌劑：
[0009] (1)用于制備木質(zhì)素纖維素復(fù)合降解酶的菌劑；
[0010] (2)用于降解木質(zhì)素和纖維素的菌劑；
[0011] (3)用于提高農(nóng)業(yè)廢棄物利用率的菌劑；
[0012] (4)用于提取中草藥或其廢棄物有效成分的菌劑。
[0013] 所述白黃小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15在制備下述（1)-(4)任一菌 劑中的應(yīng)用：
[0014] (1)用于制備木質(zhì)素纖維素復(fù)合降解酶的菌劑；
[0015] (2)用于降解木質(zhì)素和纖維素的菌劑；
[0016] (3)用于提高農(nóng)業(yè)廢棄物利用率的菌劑；
[0017] (4)用于提取中草藥或其廢棄物有效成分的菌劑。
[0018] 優(yōu)選:所述農(nóng)業(yè)廢棄物為賴桿、稻草、甘薦渣或動物糞便。
[0019] 優(yōu)選:所述中草藥為丹參。
[0020] 上述白黃小脆柄茹（Psathyrel la candol leana)BDFl 5或W白黃小脆柄茹 (Psathyrella candolleana)BDF15為活性成分的菌劑在制備木質(zhì)素纖維素復(fù)合降解酶中 的應(yīng)用。
[0021 ] 上述白黃小脆柄茹（Psathyrel la candol leana)BDFl 5或W白黃小脆柄茹 (Psathyrella candolleana)BDF15為活性成分的菌劑制備在木質(zhì)素纖維素復(fù)合降解酶時 所用的發(fā)酵培養(yǎng)基為:各成分的濃度比為:葡萄糖:教皮:牛肉膏:K出P〇4:MgS〇4 · 7出0:硫酸 銅= 20:20:5:3:1.5:0.2。
[0022] 優(yōu)選:培養(yǎng)溫度為28±rC。
[0023] 優(yōu)選:搖瓶培養(yǎng)5~6天。
[0024] 本發(fā)明所述的白黃小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15的固體培養(yǎng)為馬 鈴馨綜合培養(yǎng)基：馬鈴馨200g，麥教50g，葡萄糖20g，M gSOa . Og，蛋白陳5. Og，瓊脂20g，水 加至1000血，自然抑。培養(yǎng)條件:28± rC培養(yǎng)3~4天，菌落直徑32~36mm，7-9天長滿整個培 養(yǎng)皿;菌絲白色，拉狀，不易挑取;菌落干燥，不透明，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密。
[00巧]本發(fā)明所述的白黃小脆柄茹(Psathyrella candolleana)抓F15,其產(chǎn)酶篩選培養(yǎng) 基（即產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基）組成為:簇甲基纖維素鋼(CMC-Na)20g，蛋白腺lOg，酵母粉5g， 化C15g，K此P〇4 1. Og，MgS〇4.7此0 0.2g，瓊脂20g，蒸饋水lOOOmL，自然pH。產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基： PDA-愈創(chuàng)木酪(0.04 % )培養(yǎng)基。
[00%] 本發(fā)明所述的白黃小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng) 基組成為:葡萄糖20g，教皮20g，牛肉膏5.0g，K出P〇4 3.0g，MgS〇4 · 7出0 1.5g，硫酸銅0.2邑， 加水至ΙΟΟΟιΛ;搖瓶培養(yǎng)5~6天，培養(yǎng)溫度28±rc;發(fā)酵培養(yǎng)特征:培養(yǎng)第1天，未見明顯生 長現(xiàn)象，培養(yǎng)第2天，有菌絲球出現(xiàn)，4天后培養(yǎng)液中白色菌球數(shù)量增多，直徑變大;培養(yǎng)第5- 6天，菌絲球數(shù)量達到最大量，到了 7~9天，菌絲球集結(jié)，發(fā)酵液顏色變黃。
[0027] 菌株抓F15在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28±rC振蕩培養(yǎng)5~6d后，產(chǎn)生豐富的木質(zhì)纖維素復(fù) 合降解酶，該復(fù)合酶包括纖維素降解酶(FPA，CM化se，Cl酶，β-葡萄糖巧酶）、木質(zhì)素降解酶 漆酶W及果膠酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶等輔助酶。酶活力分別為：FPA 53.26U/mL， CMCase 73.35U/mL，Cl酶52.22U/mL，e-葡萄糖巧酶68.2洲/mL，漆酶452.84U/mL，果膠酶 13.4抓/mL、木聚糖酶27.2 lU/mL、蛋白酶45.52U/mL、淀粉酶12.54U/mL，發(fā)酵液經(jīng)8層紗布過 濾后，500化· min-i離屯、5min，取上清液即為復(fù)合酶粗制劑。
[0028] 本發(fā)明的有益效果：
[0029] 實驗證明，本發(fā)明是從白花丹參根樣品中經(jīng)過層層篩選，最終篩選出了白黃小脆 柄茹(Psathyrella candolleana)抓F15,該菌株能夠產(chǎn)生木質(zhì)素纖維素復(fù)合降解酶，提高 了木質(zhì)素的降解效率，降低了成本。
[0030] 本發(fā)明篩選的菌株制備的復(fù)合酶的方法具有酶系完整、酶活性高、操作簡單、成本 低廉等優(yōu)點，為制備復(fù)合酶提供了新途徑，避免了現(xiàn)有技術(shù)中其它各種制備方法的局限性， 具有很強的可操作性，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
[0031] 保藏說明
[0032] 菌種名稱：白黃小脆柄茹
[0033] 拉下名：（Psathyrella candolleana)
[0034] 菌株編號:BDF15
[0035] 保藏機構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、
[0036] 保藏機構(gòu)簡稱:CGMCC
[0037] 地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號 [003引保藏日期：2015年11月4日
[0039] 保藏中屯、登記入冊編號:CGMCC No. 11415
【附圖說明】
[0040] 圖1為白黃小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15在馬鈴馨綜合培養(yǎng)基上的 生長特征；
[0041 ] 圖2為白黃小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15在PDA-愈創(chuàng)木酪平板上的 產(chǎn)漆酶情況，其中，A. BDF15培養(yǎng)3加寸產(chǎn)生的漆酶氧化圈（正面）；B. BDF15培養(yǎng)3加寸產(chǎn)生的漆 酶氧化圈（背面）；C.BDF15培養(yǎng)5加寸產(chǎn)生的漆酶氧化圈（正面）；D.BDF15培養(yǎng)5加寸產(chǎn)生的漆 酶氧化圈（背面）；
[0042] 圖3為白黃小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15在液體產(chǎn)酶培養(yǎng)中的生長 狀況。
【具體實施方式】
[0043] 下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0044] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0045] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046] 馬鈴馨綜合培養(yǎng)基：馬鈴馨200g，麥教50g，葡萄糖20g，M gS化l.Og，蛋白陳5.0g， 瓊脂20g，水加至lOOOmL，自然抑。
[0047] PDA培養(yǎng)基:馬鈴馨200g，葡萄糖20g，瓊脂15~20g，自來水lOOOmL，自然抑。
[004引產(chǎn)纖維素酶篩選培養(yǎng)基組成為:簇甲基纖維素鋼(CMC-Na)20g，蛋白腺lOg，酵母粉 5g，NaCl 5g，K出P04 1.0g，MgS04.7出0 0.2g，瓊脂20g，蒸饋水 1000血，自然pH。
[0049] 產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基:PDA-愈創(chuàng)木酪(0.04% )培養(yǎng)基，具體成分包括：馬鈴馨200g，葡萄 糖20g，瓊脂15~20g，愈創(chuàng)木酪0.4g，自來水lOOOmL。
[0050] 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g，教皮20g，牛肉膏5.0g，K出P〇43.0g，MgS〇4 · 7出01.5g，硫酸銅0.2g，加水至lOOOmL。
[0化1] 一、白黃小脆柄茹(Psathyrella candolleana)BDF15分離
[0052]從山東省泰安市泰山（海拔800m)采集健康無病癥的白花丹參（Sal via miltio;r;rhizaBunge.f.a化aC.Y.WuetH.W.Li)，去腐葉，用清水洗去泥沙及其它雜質(zhì)， 沖洗干凈，置于濾紙上自然風(fēng)干。將白花丹參的根切成約0.5cm的小段，置于干