一株產(chǎn)天冬氨酸脫羧酶的菌株及用于生產(chǎn)丙氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一株生產(chǎn)心天冬氨酸α-脫簇酶的菌株，W及 利用該菌株生產(chǎn)的心天冬氨酸α-脫簇酶發(fā)酵液催化制備β-丙氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] β-丙氨酸是天然存在的唯一 β型非蛋白氨基酸，用于合成肌膚、泛酸巧、己柳氮及 帕米憐酸鋼等醫(yī)藥產(chǎn)品，用途非常廣泛。目前0-丙氨酸主要采用化學(xué)合成法，成本高、條件 及生產(chǎn)環(huán)境不友好等缺點，開發(fā)綠色安全的生物法生產(chǎn)工藝將具有十分明顯的經(jīng)濟和社會 效益。心天冬氨酸α-脫簇酶化-aspa;rtatea-deca;rboxylase，EC4.1.1.11，PanD)是泛酸生物 合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化k天冬氨酸脫簇基生成β-丙氨酸，利用該酶W廉價的k天冬氨 酸為原料可W實現(xiàn)0-丙氨酸綠色高效的工業(yè)生產(chǎn)。
[0003] PanD 在大腸桿菌（Escher i ch ia CO 1 i )、結(jié)核分枝桿菌（My cobacterium tuberculosis)、沙口氏菌（Salmonella typhimurium)、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutami州m)及幽口螺桿菌化elicobacter pylori)等微生物中均有存在，目前研究較多 的是大腸桿菌和結(jié)核分枝桿菌。國內(nèi)外研究者利用上述菌株做了很多研究工作，如美國NSC 技術(shù)有限公司擴增表達了E. coli來源的化nD基因，測得該酶酶活為0.115mmol/g · h， 畑opra等人擴增了致病菌Mycobacterium tuberculosis來源的化nD基因并在E. coli BL2UDE3)中表達，粗酶液酶活達到0.035mmol/g .h，高麗娟等將E. coli D冊α來源的panD 在E. coli BL2UDE3)中表達構(gòu)建工程菌，酶活為224.9611/1;洪敏等將E. coli D冊a panD 連接到祀T28c( + )載體，轉(zhuǎn)化E. coli化21(DE3)，經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)重組菌酶活為186 U/L發(fā)酵 液。W上報道受限于較低的酶活力，距離工業(yè)化應(yīng)用尚有較大的距離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供從葡萄園中分離得到的一株高效生產(chǎn)心天冬氨酸α-脫簇酶 的菌株，并應(yīng)用該菌株產(chǎn)生的心天冬氨酸α-脫簇酶酶法制備β-丙氨酸的方法。
[0005] 本發(fā)明所提供的產(chǎn)心天冬氨酸α-脫簇酶的菌株是從煙臺地區(qū)葡萄園±壤中分離 得到，運是一株心天冬氨酸α-脫簇酶分泌能力極高的菌株，培養(yǎng)方法簡單，生長速度快，不 易變異，可W直接用于酶法制備0-丙氨酸。將其編號為化nD37,保藏于中國普通微生物菌種 保藏管理中屯、，保藏日期為2015年2月2日，分類命名為特基拉芽抱桿菌（Bacillus 16911116郵18化11〇37)，保藏編號為：〔610：齡.10506。該菌株的168扣魁基因序列已遞交 到了GenBank數(shù)據(jù)庫。在ht1:p: //www. ncbi . nlm. nih. gov/網(wǎng)站上用blast程序與已登錄細菌 菌株的16S rDNA基因序列進行比較，結(jié)果表明菌株化nD37與Bacillus tequilensis相似度 最高，達到99%。
[0006] 本發(fā)明所述菌株的レ天冬氨酸α-脫簇酶的發(fā)酵生產(chǎn)及用于催化制備β-丙氨酸的 方法如下： 1、培養(yǎng)基配制 (1)固體保藏培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白腺10 g/L，化Cl 5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0，121°C高壓蒸汽滅菌20min; (2)液體種子培養(yǎng)基:酵母浸粉5 g/L，蛋白腺10 g/L，化Cl 5 g/L，pH 7.0，12rC高壓蒸汽滅菌20min;(3)發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，蛋白腺20 g/ L，天冬氨酸 2 g/L，MgS〇4 0.2 g/L，硫酸錠 3 g/L，K此PO4O.5 g/L，pH 7.0，115°C高壓 蒸汽滅菌20min; 2、 菌株活化:挑取菌種劃線接種至固體保藏培養(yǎng)基，于恒溫培養(yǎng)箱30°C培養(yǎng)14~20h; 3、 液體種子制備:挑取1環(huán)活化菌株接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的500mlS角瓶中，八 層紗布封口，于30°C，160~20化/min搖床振蕩培養(yǎng)12~24h，得液體種子； 4、 液體發(fā)酵:按5~10%接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基接入液體種子，轉(zhuǎn)速200~70化/min，溶氧 控制20~50%，抑7.0~7.5,溫度25~37°C，通氣培養(yǎng)24~4她，得到心天冬氨酸α-脫簇酶的 發(fā)酵液； 5、 催化制備β-丙氨酸:將心天冬氨酸α-脫簇酶的發(fā)酵液置于轉(zhuǎn)化罐中，每lOOmL發(fā)酵液 投放心天冬氨酸1~3g，用鹽酸調(diào)抑至6.0~8.0，溫度35~45°C，敞口散氣，維持轉(zhuǎn)速在50~ 100 r/min，反應(yīng)5~lOh。
[0007] 本發(fā)明的優(yōu)點在于： 1、 本發(fā)明提供的特基拉芽抱桿菌，不同于W往的心天冬氨酸α-脫簇酶產(chǎn)生菌種，尚未 有該菌株產(chǎn)心天冬氨酸α-脫簇酶的報道，進一步拓寬了 β-丙氨酸生產(chǎn)的菌種渠道； 2、 本發(fā)明所提供的特基拉芽抱桿菌化nD37遺傳穩(wěn)定性好，培養(yǎng)基成分簡單原料成本 低，產(chǎn)生的心天冬氨酸α-脫簇酶酶活力高，可直接利用該菌株發(fā)酵液直接轉(zhuǎn)化β-丙氨酸，工 業(yè)應(yīng)用具有優(yōu)勢； 3、 心天冬氨酸α-脫簇酶可W自然滲透細胞外，催化合成β-丙氨酸時無需加入表面活性 劑、有機溶劑等透膜劑，避免引入外源雜質(zhì)，有利于提取分離操作。
【具體實施方式】
[0008] 為闡明對本項發(fā)明特征的理解，下面結(jié)合一些非限定性的實施實例對本發(fā)明做進 一步闡述。
[0009] 實施例1:特基拉芽抱桿菌菌株分類 1) 菌種特性 在保藏培養(yǎng)基上菌落呈乳白色、近圓形、表面干燥、不透明、有權(quán)皺、無光澤、邊緣不規(guī) 則成裂葉狀、易挑取;通過顯微鏡觀察，菌體呈桿狀，單個不成鏈，革蘭氏陽性，培養(yǎng)4她后觀 察芽抱著生在菌體側(cè)端位置或游離存在，不膨大，楠圓形或柱形； 2) 菌株鑒定 經(jīng)DNA提取、PCR擴增和測序獲得的16S rDNA基因序列長度為1459 bp，在GenBa址上進 行BLAST比對，得出該菌株與特基拉芽抱桿菌Bacillus tequilensis(JX412373)堿基相似 性達99%，序列信息詳見說明書核巧酸和氨基酸序列表； 3) 菌種保藏 本項發(fā)明所述的特基拉芽抱桿菌化nD37(Bacillus tequilensis F*anD37)，已于2015 年2月2日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號：CGMCC No. 10506，保藏單位地址:北京市中國科學(xué)院微生物研究所。
[0010] 實施例2 1) 菌株活化:挑取菌種至固體保藏培養(yǎng)基:酵母浸粉5 g/L，蛋白腺10 g/L，化Cl 5 g/ L，瓊脂20 g/L，pH 7.0,劃線接種于恒溫培養(yǎng)箱30°C培養(yǎng)20h; 2) 液體種子制備:挑取1環(huán)活化菌株接種于裝有50ml種子培養(yǎng)基的500mlS角瓶中，液 體種子培養(yǎng)基組分:酵母浸粉5 g/L，蛋白腺10 g