一種酯酶bse00077及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種醋酶BSE00077及其編碼基因 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 醋酶化C 3.1.1.1)廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物中，是一類催化水解或形成醋 鍵的酶，作用的底物通常是脂肪鏈小于十個(gè)碳原子的醋類。醋酶屬于α/β折疊水解酶超家 族，催化中屯、由絲氨酸、天冬氨酸/谷氨酸和組氨酸組成，保守序列為絲氨酸附近的五膚 (GXSXG)序列。醋酶能催化水解、醋化、轉(zhuǎn)醋化等多種化學(xué)反應(yīng)，是一種很重要的工業(yè)生物催 化劑，被廣泛運(yùn)用于精細(xì)化工、洗涂、醫(yī)藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、廢水處理和飼料工 業(yè)等領(lǐng)域。從催化特性來(lái)看，醋酶具有高度的化學(xué)選擇性和立體異構(gòu)選擇性，且反應(yīng)不需要 輔酶、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少。在生產(chǎn)應(yīng)用中的醋酶的另一顯著特點(diǎn)是它能在異相系統(tǒng) (即油-水界面)或有機(jī)相中作用。在水相中，醋酶通常催化水解反應(yīng)，而在有機(jī)相中，它卻能 催化醋化和轉(zhuǎn)醋化反應(yīng)。通過(guò)微生物醋酶的生物轉(zhuǎn)化制備新型藥物中間體或者去除藥物消 旋體的非有效成分，是一種重要的手性技術(shù)，有著非常廣闊的應(yīng)用前景，它可W為合成手性 藥物提供新的平臺(tái)，為大量制備光學(xué)純化合物提供新的方法。酶法選擇性拆分消旋體化合 物，具有立體專一性高，副反應(yīng)少，產(chǎn)率高，產(chǎn)物光學(xué)純度好W及反應(yīng)條件溫和的優(yōu)點(diǎn)，所W 是一種被廣泛認(rèn)可的拆分方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種新的醋酶BSE00077及其編碼基因和應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明從一株來(lái)自海洋的芽抱桿菌(Bacillus sp.)SCSI0 15121中開(kāi)發(fā)得到一種 醋酶BSE00077及其編碼基因醋酶基因 bse00077,構(gòu)建了含有醋酶基因 bse00077的重組表達(dá) 載體和基因工程菌，培養(yǎng)基因工程菌后獲得醋酶BSE00077,其可應(yīng)用于催化醋類水解反應(yīng)。
[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種醋酶85600077，其氨基酸序列如56〇10^).2所 /J、- 〇
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種編碼所述的醋酶BSE00077的醋酶基因 bse00077。
[0007] 優(yōu)選，所述的醋酶基因 bse00077的核巧酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[000引本發(fā)明還提供一種含有所述的醋酶基因 bse00077的重組表達(dá)載體。所述的重組表 達(dá)載體，優(yōu)選祀T-28a (+)載體。
[0009] 本發(fā)明還提供一種含有所述的醋酶基因 bse00077的基因工程菌。所述的基因工程 菌，優(yōu)選大腸桿菌化21 (DE3)。
[0010] 本發(fā)明的第Ξ個(gè)目的是提供所述的醋酶BSE00077在催化醋類水解中的應(yīng)用。
[0011] 優(yōu)選，所述的應(yīng)用為醋酶BSE00077在催化乙酸蘇合香醋水解生成(R)-1-苯乙醇中 的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述的醋酶BSE00077在耐受正己燒和/或正庚燒環(huán)境 下進(jìn)行催化的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的醋酶基因 bse00077來(lái)自深海來(lái)源的芽抱桿菌（Bacillus SP. )SCSI0 15121(其來(lái)源為:89° 29.22'E，10°00.12'N，-3400m，pH7.8,2°C)，保存在中國(guó)科學(xué)院南海海 洋研究所。本發(fā)明利用生物信息學(xué)分析方法，從基因組測(cè)序的芽抱桿菌(Bacillus SP.) SCSI0 15121中克隆得到醋酶基因 bse00077,全長(zhǎng)為74化p(從起始密碼子到終止密碼子）， 其編碼的醋酶BSE00077含有246個(gè)氨基酸。將醋酶基因 bse00077與表達(dá)載體祀T-28a( + )連 接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌化2UDE3)，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)后，得到了重組醋酶BSE00077。將純化的醋 酶BSE00077作為催化劑催化醋類水解反應(yīng)，具有較好的穩(wěn)定性，而且對(duì)部分表面活性劑及 有機(jī)溶劑的具有很好的耐受性。醋酶BSE00077的特性符合洗涂劑添加劑、綠色化工業(yè)上需 求，可用于洗涂劑、生物醫(yī)藥、化妝品和精細(xì)化工等領(lǐng)域。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1是醋酶BSE00077的SDS-PAGE電泳圖。其中，Μ為蛋白marker,泳道1為IPTG誘導(dǎo) 前的含有祀T-28a( + )-bse00077的大腸桿菌化2UDE3)粗蛋白，泳道2為IPTG誘導(dǎo)后的含有 祀T-28a( + )-bse00077的大腸桿菌化2UDE3)粗蛋白，泳道3為純化的醋酶BSE00077蛋白。
[0015] 圖2是醋酶BSE00077對(duì)不同側(cè)鏈長(zhǎng)度酷基的對(duì)硝基苯酪醋的特異性。
[0016] 圖3是抑對(duì)醋酶BSE00077活性的影響。
[0017]圖4是不同抑對(duì)醋酶BSE00077的穩(wěn)定性影響。
[0018] 圖5是溫度對(duì)醋酶BSE00077活性的影響。
[0019] 圖6是不同溫度對(duì)醋酶BSE00077穩(wěn)定性的影響。
[0020] 圖7是醋酶BSE00077拆分乙酸蘇合香醋的GC圖。
[0021] 圖8是底物濃度對(duì)醋酶BSE00077拆分的影響。
[0022] 圖9是醋酶BSE00077拆分乙酸蘇合香醋反應(yīng)隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0023] W下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0024] 實(shí)施例1:醋酶基因 bse00077開(kāi)放閱讀框邊界確定及引物設(shè)計(jì)
[00巧]提取芽抱桿菌(Bacillus sp.)SCSI0 15121的基因組DNA，經(jīng)全基因組測(cè)序后，利 用生物信息學(xué)手段對(duì)基因組進(jìn)行基因注釋，分析其中的醋酶基因，確定了其中醋酶基因 bse00077的開(kāi)放閱讀框，其基因序列如SEQ ID NO. 1所示，全長(zhǎng)為74化P(從起始密碼子到終 止密碼子），其編碼的醋酶85600077的氨基酸序列如56〇10^.2所示，共246個(gè)氨基酸。根 據(jù)分析得到的醋酶基因 bse00077序列，設(shè)計(jì)全長(zhǎng)擴(kuò)增引物如下：上游引物：5^ - TGCTAGCCATATGAAAGTTGTGACACCAAAACC-3^ (下劃線為Ndel酶切位點(diǎn)）；下游引物：5'- AGGAAGCTTTTACCAATCGAGCTTCTCTAAAA-3^ (下劃線為HindllI酶切位點(diǎn)）。
[00%] 實(shí)施例2:醋酶基因 bse00077的克隆及載體構(gòu)建
[0027] 2.1PCR 擴(kuò)增
[0028] 將實(shí)施例 1 設(shè)計(jì)的引物（上游引物：5' -TGCTAGCCATATGAAAGTTGTGACAC-CAAAACC- 3^ ;下游引物:5^ -AGGAAGCTTTTACCAATCGAGCTTCTCTAAAA-3^ )送至上海生物工程有限公司合 成，合成的引物使用TE緩沖液溶解成終濃度為ΙΟμΜ，W提取的芽抱桿菌(Baci 1 lus SP .) SCSIO 15121總DM作為DM模板，建立如表1所示反應(yīng)體系：
[0029] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0030]
[0031] 使用W下PCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增醋酶基因 bse00077:94°C變性5min; 94°C變性Imin，62 °C退火30s，72°C延伸1.5min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmin，冷卻到18°C。
[0032] 將PCR產(chǎn)物在0.8 %瓊脂糖凝膠中，120V電壓下電泳20min，置于凝膠成像系統(tǒng)中觀 察，回收75化P左右的條帶。PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒的方法進(jìn)行回收，使用20化無(wú)菌水洗 脫，得到純化回收的PCR產(chǎn)物。
[0033] 2.2 酶切
[0034] PCR產(chǎn)物使用W下體系進(jìn)行酶切，酶切時(shí)間1.化。酶切體系為:NdeI化L，化nd III 1化，DNA<0.3yg，滅菌的雙蒸水加至50化。酶切后按照膠回收試劑盒方法回收得到經(jīng)過(guò)雙酶 切的PCR產(chǎn)物。
[0035] 質(zhì)粒祀T-28a( + )的雙酶切:挑取含有該質(zhì)粒的大腸桿菌D冊(cè)α單菌落，過(guò)夜培養(yǎng)。使 用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用NdeI和化nd III按W下體系雙酶切，酶切時(shí)間1.化。酶切體 系為:Ndel化L，化nd III 1化，DNA<0.3yg，滅菌的雙蒸水加至50化。酶切后在0.8%瓊脂糖 凝膠中電泳，按照膠回收試劑盒方法回收得到經(jīng)過(guò)雙酶切的線性祀T-28a( + )載體。
[0036] 上述雙酶切使用的限制性內(nèi)切酶為化ermo公司生產(chǎn)的快速內(nèi)切酶，酶切后的純化 回收使用核酸純化回收試劑盒(Magen，Hipure Gel化re DNA Micro Kit),質(zhì)粒提取試劑 盒為上海捷瑞生物工程有限公司的質(zhì)粒小量制備試劑盒，操作方法按其使用說(shuō)明書(shū)。
[0037] 2.3 連接
[0038] 將經(jīng)過(guò)雙酶切的PCR產(chǎn)物和雙酶切的線性pET-28a( + )載體按W下體系進(jìn)行連接： 雙酶切PCR產(chǎn)物扣L，雙酶切的線性祀T-28a(+)載體0.扣L，T4連接酶(5UAiL)0.5化，連接緩 沖液X5 X )