Zc3hav1基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，設(shè)及一種ZC3HAV1基因及其 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒是含有8個(gè)RNA基因組片段的負(fù)鏈RNA病毒。高致病性禽流感化ighly 化thogenic Avian Influenza,HPAI)是由正黏病毒科流感病毒屬A型流感病毒引起的W禽 類為主的烈性傳染病。
[0003] 水禽包括家鴨是流感病毒的天然宿主，所有16種HA和9種NA的不同組合的亞型都 能在水禽中分離。流感病毒對水禽一直保持著低致病力的特征，水禽感染病毒并不發(fā)病，但 可W向外界排毒。某些對水禽致病力低的毒株，對雞或其他宿主則表現(xiàn)為高致病性。然而， 隨著流感病毒的不斷進(jìn)化，水禽與流感病毒的平衡狀態(tài)被打破。如2002年首次報(bào)道在香港 出現(xiàn)致死水禽的冊N1亞型毒株，2005年青海湖大規(guī)模爆發(fā)冊N1亞型流感病毒致死候鳥事件 等。在人群中流行的新毒株出現(xiàn)有多種方式:禽流感病毒或其他流感病毒與人流感病毒發(fā) 生基因重排產(chǎn)生感染人的流行毒株、禽流感病毒在豬體內(nèi)適應(yīng)后產(chǎn)生的流行株、禽流感病 毒傳播到人產(chǎn)生流行毒株W及人流感病毒老毒株時(shí)隔數(shù)年后又重新流行，此外，還有人流 感病毒本身的抗原漂移等。
[0004] 總之，A型流感病毒的最大特點(diǎn)是宿主廣泛，亞型眾多，變異形式多樣，發(fā)病突然， 流行性、致病性強(qiáng)，易誘發(fā)嚴(yán)重并發(fā)癥，危害巨大。因此，目前在研究流感病毒的變異、進(jìn)化、 流行與分布規(guī)律，提高防控流感能力的同時(shí)，也致力于鑒定新的抗流感病毒的免疫基因，解 析宿主影響流感病毒感染性、致病力W及免疫應(yīng)答的分子機(jī)理研究，W提高宿主的抗病性 能及促進(jìn)防控流感病毒新手段的開發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種與新的抗流感病毒的免疫基因，W及提供該基因在抗流 感病毒中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)水禽包括家鴨是冊N1亞型流感病毒的儲(chǔ)存宿主，早 期病毒不致死水禽，感染病毒的水禽自身也不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，隨著病毒的不斷進(jìn) 化，對水禽高致病力的毒株也隨之出現(xiàn)。因此發(fā)明人通過研究比對感染兩種亞型H5N1毒株 的北京鴨的差異基因表達(dá)尋找抗性或易感相關(guān)的基因。從而發(fā)現(xiàn)并提供了一種鴨的 ZC3HAV1基因，所述ZC3HAV1基因具有：
[0007] a)SEQ ID N0.1所示的核巧酸序列;或
[000引b)SEQ ID No. 1所示核巧酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核巧酸所獲得 的具有同等功能的由a)衍生的核巧酸序列。
[0009] 本發(fā)明還提供了所述的ZC3HAV1基因所編碼的氨基酸序列。
[0010] 本發(fā)明還提供了含有所述ZC3HAV1基因的載體。
[0011]優(yōu)選的，所述載體為導(dǎo)入ZC3HAV1基因 CDS序列后獲得的PiggyBac-ZC3HAVl載體。 [0012]本發(fā)明還提供了含有所述的ZC3HAV1基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。
[0013] 所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可W為禽類細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0014] 優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為雞胚成纖維永生化細(xì)胞系DF1。
[001引本發(fā)明還提供了所述的ZC3HAV1基因在影響流感病毒復(fù)制中的應(yīng)用。
[0016] 可選的，所述流感病毒包括冊N1型AIV病毒，例如可W為低致病力的毒株GS/65(A/ goose/Hubei/65/05)和高致病力的毒株 DK/49(A/duck/Hubei/49/05)。
[0017] 可選的，所述應(yīng)用包括通過ZC3HAV1基因在細(xì)胞中的過表達(dá)來抑制AIV病毒在細(xì)胞 中的復(fù)制，W及在敲除ZC3HAV1的細(xì)胞中AIV病毒的復(fù)制顯著增加。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的構(gòu)建方法，所述方法包括在動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)入本發(fā) 明所述的ZC3HAV1基因。
[0019] 本發(fā)明所述ZC3HAV1基因可用于制備抗流感病毒的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，此外，敲除 ZC3HAV1基因的細(xì)胞系可W作為AIV等病毒疫苗生產(chǎn)的工具細(xì)胞。
[0020] 本發(fā)明所提供的ZC3HAV1基因可用于抑制流感病毒，特別是可W顯著抑制AIV病毒 的復(fù)制，因此可W針對鴨ZC3HAV1基因進(jìn)行深入的功能研究，從而確定其抗AIV病毒的關(guān)鍵 蛋白結(jié)構(gòu)域或氨基酸。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)等基因編輯方法，獲得可誘導(dǎo)性高表達(dá)ZC3HAV1基因 的轉(zhuǎn)基因畜禽，培育出抗AIV等多種類型病毒的轉(zhuǎn)基因農(nóng)業(yè)動(dòng)物優(yōu)良品種。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到的鴨ZC3HAV1基因 mRNA序列。
[0022] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中所述載體PiggyBac的圖譜，其中X gene為ZC3HAV1。
[002；3]圖3為本發(fā)明實(shí)施例4、5中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ZC3HAV1W及陰性對照質(zhì)粒24h后DF1細(xì)胞的鏡 下觀察結(jié)果。
[0024] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例4、5中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ZC3HAVm及陰性對照質(zhì)粒4她后，收取細(xì)胞總 蛋白后對ZC3HAV1基因的過表達(dá)效果的Western blot驗(yàn)證。
[0025] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例4、5中在DF1細(xì)胞中過表達(dá)ZC3HAV1基因，抑制實(shí)施例6中流感 病毒DK/49 (左）和GS/65 (右）的復(fù)制。
[0026] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例4、5中DF1細(xì)胞感染流感病毒AIV(DK/49)4化后，內(nèi)源ZC3HAV1 基因 mRNA的表達(dá)變化，WGAPDH基因作為內(nèi)參。
[0027] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例4、5中細(xì)胞過表達(dá)ZC3HAV1基因前后，感染流感病毒AIV(DK/ 49)后，病毒不同形式RNA的相對表達(dá)變化，WGAPDH基因作為內(nèi)參。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0029] W下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0030] 若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊 (New 化rk:Gold Spring 化rbor LaboratoiT Press, 1989)，或按照制造廠商說明書建議 的條件。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 利用分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)新的抗AIV感染的基因 ZC3HAV1。
[0033] 水禽包括家鴨是冊N1亞型流感病毒的天然宿主，其感染部分冊N1亞型病毒后，不 表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。隨著病毒的不斷進(jìn)化，對水禽高致病力的毒株也隨之出現(xiàn)。本研究 選取兩種H5N1亞型毒株（即高致病性的A/duck/Hubei/49/05(DK/49)及低致病性的A/ gooseMubei/65/05(GS/65)冊N1病毒），感染4周齡紹興麻鴨。通過高通量測序的方法，分別 構(gòu)建感染DK/49或GS/65冊N1流感病毒后1天、2天和3天鴨的W及對照組鴨的脾臟、腦和肺組 織基因表達(dá)圖譜，鑒定參與機(jī)體抗流感病毒相關(guān)的免疫基因，為禽流感的治療和預(yù)防提供 新辦法。
[0034] 前期用DK/49或GS/65H5N1病毒感染4周齡紹興麻鴨，分別在感染AIV后1、2和3天 后，取脾臟、腦和肺組織樣，提取總RNA，建庫進(jìn)行高通量測序，通過生物信息學(xué)分析。分析發(fā) 現(xiàn):與對照組相比較，無論是在感染DK/49或GS/65冊N1病毒后1、2和3天的脾臟、腦和肺組織 中，ZC3HAV1的表達(dá)量均極顯著升高（如圖1所示，分別在兩株冊N1毒株(A/duck/Hubei/49/ 05，DK/49，高致病)和(A/goose/Hubei/65/05，GS/65，低致?。?，感染4周齡紹興鴨后的第1、 第2和第3天脾臟、肺和腦組織中的表達(dá)模式；橫坐標(biāo)代表時(shí)間點(diǎn)，縱坐標(biāo)代表相對表達(dá) 量。）。
[0035] 實(shí)施例2
[0036] 利用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法獲得鴨ZC3HAV1基因全長編碼區(qū)序列。
[0037] 參照Ensemble網(wǎng)站上的鴨基因組參考序列，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組拼接序列，設(shè)計(jì)鴨 ZC3HAV1基因全長CDS區(qū)克隆引物ZF/ZR，序列如下：
[0038] ZF:5，-ATGAGCGACC CGGTGGTGTG CAGCT-3,，
[0039] ZR:5'-GGGCTACAAA CAGCTCTGAT CACTT-3'。
[0040] W鴨脾臟組織cDNA為模板，利用肥B公司的Q5高保真聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn) 物經(jīng)膠回收后連接到T載體上進(jìn)行測序。序列比對分析后發(fā)現(xiàn)：鴨ZC3HAV1基因全長編碼區(qū) 為215469(569 10^.1)，共編碼717個(gè)氨基酸(569 10^.2)。
[0041] 本發(fā)明人成功克隆得到鴨ZC3HAV1基因全長編碼區(qū)序列。
[0042] 實(shí)施例3
[0043] 利用細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)方法在細(xì)胞中瞬時(shí)過表達(dá)ZC3HAV1基因
[0044] 1、鴨ZC3HAV1基因過表達(dá)載體的構(gòu)建
[0045] 根據(jù)鴨ZC3HAV1基因編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)其真核表達(dá)載體引物eZF/eZR，上、下游引物 都是分別引入Mlu巧陽me I酶切位點(diǎn)（下劃線標(biāo)注）；此外，上游引物在起始密碼子ATG之前 引入kozak(粗體標(biāo)注)序列，在目的基因 C末端引入flag標(biāo)簽(粗體標(biāo)注）。引物序列如下：
[0046] eZF：
[0047] 5，-GACGCGTGCCACCATGAGCGACCCGGTGGTGTGCA