一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體設及一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋 白方法。
【背景技術】
[0002] 植物生物反應器與復雜并昂貴的細胞培養(yǎng)為基礎的表達系統(tǒng)相比，具有安全、廉 價和可大規(guī)模生產等優(yōu)點。植物生物反應器的問世，為生產可食疫苗、藥用蛋白和提高植物 營養(yǎng)價值帶來了希望。然而，傳統(tǒng)的細胞核轉基因植物存在著外源基因表達效率低、環(huán)境安 全性差和后代不穩(wěn)定等缺點，促使人們不得不致力于尋找一條新的途徑。W質體轉基因植 物作為生物反應器，不僅能夠實現(xiàn)外源蛋白的大量表達，而且外源蛋白可W形成正確的二 硫鍵和空間構象。因此，利用質體轉基因植物生產藥用蛋白等外源物質的研究日益受到關 注，并已經成為植物基因工程的一個新的研究熱點。質體轉化最早在藍藻（1988)獲得成功， 隨后迅速在煙草上得到趨于完善的發(fā)展，并相繼在擬南芥E、番茄和甘藍等10余個物種上進 行了嘗試。40多個外源基因先后被穩(wěn)定整合進質體基因組，賦予了植物抗除草劑、抗蟲、抗 病和抗旱等新的農藝性狀，高豐量表達了疫苗、抗體和干擾素等藥用蛋白質，嘗試生產了氨 基酸、工業(yè)用酶和生物大分子等原料W3。但要實現(xiàn)外源蛋白在植物質體中的穩(wěn)定表達，有 幾個不足:一是外源基因對植物質體的遺傳轉化，是一個復雜且漫長的過程，通常要2-3年 才能實現(xiàn)，周期較長，對于急需生產應對突發(fā)疾病來說(例如SAS)，運一生產過程并不實用； 二是外源蛋白在質體中大都屬組成型表達，表達產物可能有毒或干擾植物細胞的其他新陳 代謝W，抑制了植物體的正常生長。
[0003] 利用植物體瞬時表達外源重組蛋白是植物生物反應器的一個重要研究方向，該體 系外源蛋白表達量高，實驗周期短，而且具有相對操作簡單的優(yōu)勢，但整體來看接種方式是 影響該體系實驗效率的一個關鍵因素。傳統(tǒng)的接種方式主要有摩擦接種法、葉片注射法和 離體植物組織真空侵染法，其中摩擦接種法是將含有重組基因的載體在體外轉錄，并通過 機械方式在植物葉片上制造傷口，然后W轉錄產物涂抹或噴灑于植物葉片上進行接種，該 方法操作相對比較繁瑣，實驗費用較高。目前常用的離體植物組織真空侵染法主要是利用 真空壓力對離體的植物組織如葉片等進行接種，此方法操作簡單，但是在收獲
[0004] 外源蛋白之前保持離體組織的新鮮度具有一定難度。葉片注射接種法是在活體植 物葉片上進行，要求植物具有2~3片展開的葉片，目前此種方法比較常用，但是在實驗操作 中發(fā)現(xiàn)此種接種方式很難實現(xiàn)在植物中批量的生產外源重組蛋白。本發(fā)明的目的在于提供 一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法，利用植物質體trni和trnA基因在高等植物 中高度保守的特點，根據(jù)煙草質體的trni和trnA基因序列設計引物，從馬鈴馨中克隆trnl- 化nA基因區(qū)段，并W此作為定點整合的同源區(qū)段，構建包含外源蛋白基因及質體特異性啟 動子Prrn和終止子化sbA的植物質體表達載體，對基因槍參數(shù)進行優(yōu)化，采用基因槍轟擊的 方式，在馬鈴馨塊莖的瞬時表達了個源蛋白，驗證外源蛋白的表達特性，為進一步將利用馬 鈴馨等作物器官作為生物反應器來表達外源蛋白快速生產藥用蛋白，生物抗體等奠定基 礎。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法，利用植物 質體化ηI和trnA基因在高等植物中高度保守的特點，根據(jù)煙草質體的trnI和trnA基因序列 設計引物，從馬鈴馨中克隆化nl-trnA基因區(qū)段，并W此作為定點整合的同源區(qū)段，構建包 含GFP基因（外源基因）、篩選標記基因 aadA及質體特異性啟動子Prrn和終止子化sbA的馬鈴 馨質體表達載體，通過馬鈴馨塊莖的瞬時表達GFP蛋白，驗證外源蛋白的表達特性，為進一 步將利用馬鈴馨等作物器官作為生物反應器來表達外源蛋白快速生產藥用蛋白，生物抗體 等奠定基礎。
[0006 ]本發(fā)明具體通過W下技術方案實現(xiàn)：
[0007] -種利用植物質體瞬時快速表達外源蛋白方法，包括W下步驟：
[000引1)提取馬鈴馨幼嫩葉片中的總DNA;
[0009] 2)根據(jù)馬鈴馨質體基因中的trnl-trnA基因序列設計合成了引物C1和C2:
[0010] C1:5^-t曰曰邑邑t邑tt邑邑邑tt曰曰邑tccc邑C曰曰C邑曰邑c-S^ ;
[0011] 02:5/-aactcccc邑aa邑catttc邑tc邑attactac邑CCC-3';
[001引3似供試馬鈴馨的總DNA為模板，用高保真DNA聚合酶擴增化nl-trnA基因特異片 段，連入PUC18載體，進行序列測定，得到陽性克??；
[001引 4)設計兩對引物化IUGLI2和GLAUGLA2,分別擴增陽性克隆的trn巧化rnA區(qū)段；
[0014] 5)將所擴增的化nl區(qū)段分別用Clal和化nd III進行消化，連接入經Clal和化nd III內切酶消化的地io-3載體，轉化大腸桿菌D冊α，挑取轉化菌落，獲得地MLSI-GFP;
[001引 6)用MlUI和EagΓ消化所擴增的trnA基因區(qū)段，連入經MlUI和EagI內切酶消化的 pBMLSI-g巧載體，轉化大腸桿菌D冊α，挑取轉化菌落，培養(yǎng)后提取質粒，完成GFP基因馬鈴馨 質體表達載體地MLSIA-GFP的構建。
[0016] 7)將連接正確的表達載體pBMLSIA-GFP用化Cl2法轉化大腸桿菌D冊α，挑取轉化菌 落，驗證正確后進行菌種保存。挑取含ρΒ化IA-GFP的D冊α單菌落于lOOmL液體LB培養(yǎng)基中， 37°C過夜培養(yǎng)，參考分子克隆實驗指南進行質粒大量提取，濃縮后質粒濃度達ygAU級。
[0017] 8)用0.6皿金粉包埋質粒pBMLSIA-GFP后，按照標準的PDS-1000/He基因槍系統(tǒng)操 作方法進行基因槍轉化，采用60化31、90〇931、110〇931的壓力膜，轟擊距離為6(3111條件下轉 化馬鈴馨新鮮馨片(厚度2-3mm)。塊莖轟擊2d后在UVD-19M型紫外分析儀下觀察、拍照。
[0018] 9)用可溶性蛋白提取緩沖液提取塊莖總可溶性蛋白，取15μ1上清進行SDS-PAGE電 泳（12%分離膠，3%濃縮膠)分析GFP蛋白瞬時表達，電泳膠塊脫色后拍照，采用Glyko公司 Bandscan V5.0蛋白定量軟件進行GFP蛋白表達量分析。
[0019] 其中；
[0020] 步驟(3)所述的引物具體為：
[0021 ] GLI1:5，-ccatcga1:aaggtgttgggttaagt-3，；
[0022] GLI2:5，-gccaagcttctgggccatcctggatt-3，；
[0023] GLA1:5，_c邑邑ac邑C邑tct邑C邑ccaa邑邑aaaa邑aa_3，；
[0024] GLA2:5，-gatcggccgaactccccgaag cat tt-3,。
[0025] 步驟(4)中PCR擴增體系為：100化PCR反應體系中加10 XPCR反應緩沖液10化，5' 端和3 ' 端各0.2皿〇1，5U Taq DNA聚合酶，50ng模板DNA，MgCl2為2. Ommol/L，各種dNTP為 0.2mmol/L。反應條件為:95°C總變性3min，94°C變性60s，55°C退火60s，72°C延伸180s，共進 行30個循環(huán)。
[0026] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明所構建的馬鈴馨質體定點轉化載體pB化IA-GFP，可 作為構建不同作物質體表達載體的基礎載體，也可W作為構建不同藥用蛋白基因的基礎載 體，利用該載體，可為進一步將實用基因導入馬鈴馨質體基因組進行穩(wěn)定表達，或者利用快 速瞬時表達外源蛋白來達到生產醫(yī)藥用蛋白的目的。
【附圖說明】
[0027] 圖1是馬鈴馨質體trnl-trnA基因同源區(qū)段PCR擴增產物；
[002引圖2是質體表達載體地MLSIA-GFP的PCR鑒定;M:分子量標準化2000;l.trnl基因同 源區(qū)段;2.trnA基因同源區(qū)段；
[0029] 圖 3 是pBMLSI-GFP和 pBMLSIA-GFP 的酶切鑒定；M:分子量標準化2000;1.9811^51- GFP;2.pBMLSI-GFP EcoR I&Hind III酶切；3.PBMLSIA-GFP MluI&EagI酶切；4.PBMLSIA- GFP；
[0030] 圖4是GFP基因在馬鈴馨塊莖中瞬時表達后產生的綠色巧光；A: 1100psi;B: 600psi ; C: 1 loopsi，2次;D: 900psi ;E:未轉化對照；
[0031 ] 圖5是質體表達載體pBMLSIA-GFP在塊莖中的可溶性蛋白SDS-PAGE電泳。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，W下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施 例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術人員可能利用上述掲示 的技術內容加 W變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內容，依據(jù)本發(fā)明 的技術實質對W下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內。
[0033] 1、材料與試劑
[0034] 馬鈴馨材料為云南廣泛栽培的馬鈴馨品種會-2 "GFP基因煙草質體表達載體 pBio3-GFP由下雄飛博:t惠贈 (Bioclone Inc, San Diego,USA),其上帶有煙草trnl-trnA基 因區(qū)段，篩選標記基因 aadA(壯觀霉素抗性基因）及質體特異性啟動子Prrn和終止子化sbA。 GFP基因屬于Ξ點突變型綠色巧光蛋白化eim et al.，1995)?？寺≥d體PUC18為Promega公 司產品，巧r(池詔t? DNA聚合酶、限制性內切酶、T4DNA連接酶、膠回收純化試劑盒和DNA Marker為化KaRa公司產品；0.6皿金粉和基因槍耗材構自美國BioRad公司。宿主菌D冊α為本 室保存，其它試劑均為國產分析純。
[003引 2、方法
[0036] 1)馬鈴馨基因組DNA的提取和純化：用CTAB法(Scott and Arnold, 1985)提取馬鈴 馨幼嫩葉片中的總DM。
[0037] 2)引物設計合成與PCR擴增:根據(jù)馬鈴馨質體基因組的化nl-trnA基因序列，設計 合成了 1對寡核巧酸引物C1和C2: