一種羊肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利說明】-種羊肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)増檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法 (-)技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種針對(duì)羊肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)技術(shù)，適合對(duì)羊肉源 性成分核酸的現(xiàn)場(chǎng)快速定性檢測(cè)。 (二)【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，肉制品滲假成為社會(huì)廣泛關(guān)注的食品安全問題。2013年，設(shè)及歐洲16國(guó)的 "馬肉風(fēng)波"震驚了整個(gè)歐洲。在我國(guó)，媒體也屢屢曝光了多起"掛羊頭賣狗呀'的肉類滲假 滲雜事件，其中羊肉的滲假事件最為常見。在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及個(gè)別不法商家或個(gè)人使用相對(duì)廉 價(jià)的豬肉、鴨肉等低價(jià)肉類原料和少量牛羊脂肪、下腳料混合在一起，冒充羊肉制品進(jìn)行銷 售W謀取高額利益，運(yùn)種滲假行為不僅設(shè)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食品安全等問題，還嚴(yán)重侵犯了消 費(fèi)者合法權(quán)益。
[0003] 目前，普通PCR及實(shí)時(shí)巧光定量PCR是肉制品品種鑒別最常用的方法，普通PCR法存 在耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，靈敏度不夠，容易產(chǎn)生交叉污染等缺點(diǎn)。實(shí)時(shí)巧光PCR法則有成本昂 貴，耗時(shí)長(zhǎng)，技術(shù)要求高，需要大型的儀器設(shè)備等缺點(diǎn)，因此其應(yīng)用仍存在一定的局限性。恒 溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是繼PCR技術(shù)后近年發(fā)展起來的一種新的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，本發(fā)明技術(shù)研制 了恒溫?cái)U(kuò)增羊肉源性成分核酸，并結(jié)合核酸試紙條顯色來判定檢測(cè)結(jié)果，且整個(gè)反應(yīng)過程 不打開反應(yīng)管蓋子，試紙條流動(dòng)檢測(cè)過程密閉，杜絕了核酸擴(kuò)增產(chǎn)物污染外界的可能性。研 究表明該羊肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增-核酸試紙條檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感度高、對(duì) 儀器要求簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，所W非常適用在基層檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)使用，同時(shí)在農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)上也具有很好的應(yīng)用前景。 (Ξ)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是提供一種準(zhǔn)確、靈敏、快速地檢測(cè)羊肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢 測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明提供一種羊肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括如下 組成：
[0007] (1)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液，包括:正向外圍引物、反向外圍引物、一條探針、兩條環(huán)引物、 兩條交叉擴(kuò)增引物、1 X化ermol buffer、MgS〇4、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶和無菌雙蒸水； 其中：
[000引所述的外圍引物分別為：
[0009]正向外圍引物為：5'-6〔444〔〇：4(：7^4〔4(：1'(：-3'(569 10^.2);
[0010]反向外圍引物為:5'-AGGTCGGCTACTAGGATTC-3'(SEQ ID N0.3);
[OOW 所述兩條環(huán)引物的序列分別為：
[0012] 正向：5'端Biotin標(biāo)記探針5' -Biotin-
[0013] GCGTACGCAAATAGGAAGTATCA-3'(沈Q ID N0.4);
[0014] 反向：5' -ACATCAAAGCAACGGAGCATAA-3'(沈Q ID NO. 5);
[0015] 所述兩條擴(kuò)增交叉引物分別為：
[0016] 擴(kuò)增正向引物：
[0017] 5'-GGACTCCTCCTAGTTTATTAGGGATCCCTCACATCAAACCTGAA-3'(沈Q ID NO.6);
[001引擴(kuò)增反向引物：
[0019] 5'-GTCCTAGTAATTATACCCCTCCTCCATTGACTGATTGGTCGGAAT-3'(沈Q ID NO.7);
[0020] 5'端Fite標(biāo)記探針：5'-Fitc-TCGCCCTAATCCTCTCAATCCT-3'(沈Q ID N0.8);
[0021] (2)陽(yáng)性對(duì)照:含有羊?qū)偬禺愋缘腃y憂基因片段的DM質(zhì)粒；
[0022 ] (3)陰性對(duì)照:無菌雙蒸水。
[0023] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述的 1 XTliermol buffer組成為：20mM的Tris-肥l、10mM的KC1、 lOmM的（NH4)2S〇4、2mM的MgSCkW及質(zhì)量濃度為0.1%的Triton X-100，pH 8.8。
[0024] 進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽(yáng)性對(duì)照為含有長(zhǎng)22化p的羊?qū)偬禺愋缘那衪b基因序列的片 段，所述片段的核巧酸序列如下(SEQ ID NO. 1):
[0025] GCAAACCCACTTAACACTCCCCCTCACATCAAACCTGAATGATACTTCCTATTTGCGTACGCAATCTTACGATCAAT CCCTAATAAACTAGGAGGAGTCCTCGCCCTAATCCTCTCAATCCTAGTCCTAGTAATTATACCCCTCCTCCATACAT CAAAGCAACGGAGCATAATATTCCGACCAATCAGTCAATGTATATTCTGAATCCTAGTAGCCGACCTo [00%]進(jìn)一步，本發(fā)明所述陽(yáng)性對(duì)照按如下步驟制備：
[0027] W包含擴(kuò)增區(qū)域的羊?qū)偬禺愋缘那衪b基因片段為模板，通過兩條外圍引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增獲得目的基因；利用PCR純化試劑盒(Promega)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化;將純化后 的擴(kuò)增產(chǎn)物通過T-easy質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒(Promega)構(gòu)建完整的含有目的基因的質(zhì)粒序列， 用分光光度計(jì)對(duì)所抽提的質(zhì)粒測(cè)A280定量并稀釋至10個(gè)拷貝/μ1，獲得陽(yáng)性對(duì)照，-20°C保 存。
[002引進(jìn)一步，本發(fā)明所述恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液組成為:兩條外圍引物各自5.7nmol，兩條環(huán) 引物及探針各自11.4nmol，兩條交叉引物各自22.8nmol，1 XThermol buffe;r，MgS04為0.化 mol，dNTPs溶液各35pmol，Bst DM聚合酶8U，無菌雙蒸水組成補(bǔ)足至25μ1。
[0029] 本發(fā)明還提供一種所述羊肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，所 述檢測(cè)方法為：
[0030] a)提取待檢測(cè)標(biāo)本DNA:剪取約米粒大小（50mg)的羊肉樣品，加入50化L雙蒸水后 振蕩15s，于95°C作用5min，離屯、后取上清，即獲得DNA;
[0031 ] b)將步驟a)提取得到的DNA作為模板加入到裝有恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，在65 °C下擴(kuò)增反應(yīng)30分鐘；標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板（即陽(yáng)性對(duì)照）加入陽(yáng)性對(duì)照PCR管中，標(biāo)準(zhǔn)陰性模板 (即陰性對(duì)照)加入陰性對(duì)照PCR管中，所述標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板為含有羊?qū)偬禺愋缘那衪b基因片 段的DNA質(zhì)粒，所述標(biāo)準(zhǔn)陰性模板為無菌雙蒸水；
[0032] C)將反應(yīng)后的PCR管放置到核酸試紙條防污染檢測(cè)裝置(杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)公 司3號(hào)裝置）中進(jìn)行檢測(cè)，2分鐘W后判讀結(jié)果，當(dāng)試紙條的檢測(cè)線呈陽(yáng)性時(shí)，說明樣品中含 有羊肉源性成分核酸。該試紙條包括在帶有不干膠的襯墊上按順序有樣品墊、有色顆粒結(jié) 合物墊和吸水濾紙墊，上述各部分在相鄰處部分重疊，纖維膜上設(shè)有檢測(cè)線和質(zhì)控線，其中 有色顆粒結(jié)合物墊上的有色顆粒有抗Fite抗體包被，檢測(cè)線上有親和素包被，質(zhì)控線上有 抗Fi tc抗體，有色顆粒選自膠體金顆粒、乳膠顆粒。
[0033] 在本發(fā)明提供的試劑盒中，有兩條外圍引物，兩條交叉引物和兩條檢測(cè)探針。本試 劑盒中的6條寡聚核巧酸序列依靠 Bst DNA聚合酶的高活性的鏈置換特性，使得鏈置換DNA 合成不斷的自我擴(kuò)增循環(huán)。在本發(fā)明提供的羊肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒中， 對(duì)不同的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，如引物和探針的濃度，Mgh濃度，反應(yīng)溫度等的優(yōu)化，并將本 發(fā)明與核酸檢測(cè)試紙條檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，建立了羊肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增定性檢測(cè)的 方法。該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出1個(gè)拷貝，可W滿足快速檢測(cè)羊肉源性成 分核酸的要求。
[0034] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有W下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0035] (1)本發(fā)明簡(jiǎn)化了肉樣品核酸的提取方法，減低了成本，而且大大縮短了檢測(cè)時(shí) 間。
[0036] (2)羊肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒的特異性好，靈敏度高，步驟簡(jiǎn)單， 可重復(fù)性高；
[0037] (3)反應(yīng)速度快，單個(gè)樣本從樣本處理到完成檢測(cè)，僅需40分鐘左右；
[0038] (4)整個(gè)擴(kuò)增和檢測(cè)過程中不需要打開PCR管蓋，減少了擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì);整 個(gè)反應(yīng)過程不需要復(fù)雜的儀器。 (四）
【附圖說明】
[0039] 圖1為核酸檢測(cè)試紙條原理示意圖。
[0040] 圖2為本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)羊肉源性成分核酸的特異性，圖中1-7分別表示羊 肉、雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉、陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品。
[0041] 圖3為本發(fā)明試劑盒用于檢測(cè)羊肉源性成分核酸的靈敏度，圖中1-7分別表示1〇4 拷貝/微升、1〇3拷貝/微升、1〇2拷貝/微升、1〇1拷貝/微升、10嘴貝/微升、1(^1拷貝/微升、陰 性對(duì)照品。 (五)
【具體實(shí)施方式】
[0042] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0043] 實(shí)施例1本發(fā)明試劑盒的組成與配制
[0044] a)羊肉源性成分核酸的恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液：兩條外圍引物（5.7nmol)，一條探針 (11.4nmol)，兩條環(huán)引物（11.4nmol)和兩條擴(kuò)增交叉引物（22.8nmol)，1 XThermol buf f er，MgS〇4(0.2皿〇1)，dNTPs溶液（各35pmo 1)，Bst DNA聚合酶（洲)和無菌雙蒸水組成， 總反應(yīng)液體積為25μ