棒曲霉素的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米生物傳感以及生物檢測領(lǐng)域，具體地說，是提供一種棒曲霉素的檢測方法及檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]棒曲霉素是由霉菌產(chǎn)生的一種有毒的真菌代謝產(chǎn)物。能夠產(chǎn)生棒曲霉素的霉菌，主要包括青霉屬、曲霉屬、絲衣霉等霉菌，這些霉菌，可廣泛地感染多種水果、蔬菜、糧食、飼料和中藥材，導致這些作物及其制品受棒曲霉素污染。如受這些霉菌感染的蘋果，距其霉爛斑點3厘米處的果肉中，仍可檢出棒曲霉素。棒曲霉素對熱穩(wěn)定，100°C加熱15分鐘仍然不能破壞其結(jié)構(gòu)，且在酸性溶液及有機溶劑中能長期保存。棒曲霉素曾因為其抑制多種菌生長而被用作抗生素，它具有引起抽搐、腸道出血、肺部出血、腎臟損害等急性毒性，棒曲霉素對神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等都具有較強的毒性。同時具有基因毒性、致畸、致癌等慢性毒性。目前檢測棒曲霉素的方法有:色譜法、色譜聯(lián)用技術(shù)、酶聯(lián)免疫法等。這些方法檢出限低、精密度高，但操作復雜、檢測成本高。建立一種快速、簡單、低成本的棒曲霉素檢測方法有重要意義。
[0003]中國專利CN104593374A公開了一種特異識別棒曲霉素的寡核苷酸適配體，其可用于棒曲霉素的檢測，但未見用于棒曲霉素的檢測的進一步應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供一種檢測棒曲霉素的方法。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案:一種檢測棒曲霉素的方法，包括如下步驟:
(A)使棒曲霉素核酸適體(Apt)與單鏈信號探針ssDNA(Sp)雜交，形成雜交鏈；
(B)使該雜交鏈與待測樣品作用，當待測樣品中有棒曲霉素存在時，雜交鏈選擇性地與棒曲霉素反應釋放出單鏈信號探針s sDNA;
(C)消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用外切酶，選擇性地催化雙鏈DNA水解成單核苷酸，體系中單鏈信號探針ssDNA不水解而保留下來；(D)利用棒曲霉素核酸適體-棒曲霉素結(jié)合體不能誘導銀離子還原成近紅外熒光銀納米簇，只有單鏈信號探針ssDNA(Sp)能誘導生成具有強熒光的近紅外銀納米簇，檢測體系中熒光強度，從而測定待測樣品中的真菌毒素棒曲霉素的含量。
[0006]所述棒曲霉素核酸適體為 5，-CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACTGATATTTTACCTT
GACTATCAGTCGTGC-3’。
[0007]所述可與棒曲霉素核酸適體雜交的單鏈信號探針DN A為5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3’。
[0008]本發(fā)明的檢測原理如下:先讓Apt與Sp雜交(下劃線部分)；當有棒曲霉素存在時，雜交鏈與棒曲霉素反應釋放出Sp;體系中存在Apt-Sp(剩余的)，Apt-棒曲霉素和Sp Jpt-棒曲霉素不能誘導銀離子還原生成近紅外熒光的銀納米簇，對測定無干擾;雜交鏈可能有干擾;為了消除雜交鏈的干擾:a.利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，b.用核酸外切酶，選擇性地催化雙鏈DNA水解成單核苷酸，體系中單鏈信號探針ssDNA未水解而保留下來;此時體系中只留下可誘導生成近紅外熒光的銀納米簇的Sp，以波長為585 nm的光為激發(fā)光，測定體系熒光發(fā)射(610-800 nm)光譜的熒光強度，依據(jù)熒光強度與棒曲霉素的量的關(guān)系，從而可以測定真菌毒素棒曲霉素的含量。由于消除體系中背景熒光的干擾，可以提高檢測的靈敏度和精度。
[0009]本發(fā)明還提供了一種檢測棒曲霉素的試劑盒，其至少包括:棒曲霉素核酸適體、可與棒曲霉素核酸適體雜交的單鏈信號探針ssDNA、DNA擴增體系、核酸外切酶、銀離子還原檢測體系。
[0010]所述棒曲霉素核酸適體為5 ’ -CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACTGATATTTTACCTT GACTATCAGTCGTGC-3’。
[0011 ]所述的單鏈信號探針ssDNA為5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3 ’。
[0012]所述DNA擴增體系包括緩沖溶液，緩沖溶液由Tris-HCUMgCl2和(NH4)2SO4組成，三磷酸脫氧單核苷酸混合溶液dNTP和Phi29 DNA聚合酶。
[0013]所述核酸外切酶為ExoIII核酸外切酶。
[0014]所述的銀離子還原檢測體系中的還原劑為抗壞血酸。
[0015]本發(fā)明還提供了一種可用于檢測棒曲霉素的棒曲霉素核酸適體，其堿基序列為5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACT
GATATTTTACCTT GACTATCAGTCGTGC-3’。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點:
采用本發(fā)明的檢測方法和試劑盒，可以消除干擾，0.008-0.30 ng/mL，檢測限3 pg/mL。
【附圖說明】
[0017]圖1為Sp-Ag納米簇熒光與棒曲霉素的濃度關(guān)系圖。
【具體實施方式】
[0018]實施例1
一種檢測棒曲霉素的試劑盒至少包括:棒曲霉素核酸適體、可與棒曲霉素核酸適體雜交的單鏈信號探針DNA、DNA擴增體系、核酸外切酶、銀離子還原檢測體系。棒曲霉素核酸適體為5 ’ - CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACTGATATTTTACCTTGACTATCAGTCGTGC-3 ’。單鏈信號探針DNA為5 ’ -CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3 ’。DNA擴增體系包括緩沖溶液(緩沖溶液由Tris-HCUMgCl2和(NH4)2SO4組成)，三磷酸脫氧單核苷酸混合溶液dNTP和Phi29 DNA聚合酶。。核酸外切酶為Exo III核酸外切酶。所述的銀離子還原檢測體系中的還原劑為抗壞血酸。
[0019]實施例2
一種檢測棒曲霉素的方法，具體操作過程如下:
將各DNA儲備液在95°C下經(jīng)加熱處理5分鐘，使用前，并在室溫下放置30分鐘。然后，分別取含3.0 μπιο?棒曲霉素核酸適體(Apt)的雜交緩沖溶液40 μ!^Ρ3.0 μπιο?信號探針ssDNA(Sp)的雜交緩沖溶液40 yL置于2ml離心管中，在37°C下雜交I小時，生成棒曲霉素核酸適體-信號探針雜交物(Apt -Sp) ο
[0020]在37°C下，分別依次將濃度為O?50 ng/mL的棒曲霉素添加到Apt-Sp溶液中，棒曲霉素與Apt-Sp中Apt段反應，生成核酸適體-棒曲霉素，釋放出Sp。這時，體系中有Sp、剩余(未反應的)Apt-Sp和核酸適體-棒曲霉素等物質(zhì)。
[0021 ] 加入10 yL緩沖溶液(緩沖溶液組成為50mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2,10 mM(NH4)2SO4lPH 7.5 )，然后加入dNTP (10 mM) 18 yL。再向體系中加入2yL Phi29 DNA 聚合酶(10 u/μ?),在37°C下反應15分鐘，使得以棒曲霉素核酸適體-信號探針雜交序列(Ap-Sp)為摸板擴增成雙鏈DNA。在65°C下保持10分鐘使Phi29 DNA去活。
[0022]再向該反應體系中加入2yL Exo III核酸外切酶(20 u/yL)，在37°C下反應30分鐘，Exo III選擇性地催化雙鏈DNA水解成單核苷酸，單鏈信號探針Sp不水解而保留下來。
[0023]向反應液中加入25 yL I mmol硝酸銀和180Λ檸檬酸鈉緩沖液(10 mM，pH7.8)。然后，混合物在室溫下避光或暗室中放置10分鐘后，在快速攪拌下，加入10yL濃度為ImM的新制備的抗壞血酸溶液。然后在45°C下反應5min。將溶液轉(zhuǎn)移至微量比色皿，以波長為585nm的光為激發(fā)光，測定體系熒光發(fā)射(610-800 nm)光譜的熒光強度，依據(jù)熒光強度與棒曲霉素的量的關(guān)系，進行棒曲霉素的定量測定，結(jié)果如圖1所示。
[0024]線性范圍0.005-0.30 ng/mL，線性方程為y = 32.28 + 775.8 C，相關(guān)系數(shù)為r =
0.9969，檢測限3pg/mL，回收率在96.5?106.2%。其它真菌毒素等生物小分子對棒曲霉素的檢測無干擾。
【主權(quán)項】
1.一種棒曲霉素的檢測方法，其特征是，該方法包括如下步驟: (A)棒曲霉素核酸適體Apt與單鏈信號探針ssDNA雜交，形成雜交鏈； (B)使該雜交鏈與待測樣品作用，當待測樣品中有棒曲霉素存在時，雜交鏈中Apt段選擇性地與棒曲霉素反應生成Apt-棒曲霉素，同時釋放出單鏈信號探針ssDNA; (C)消除雜交鏈的干擾，利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用外切酶選擇性地催化雙鏈DNA水解成單核苷酸，體系中單鏈信號探針ssDNA不水解而保留下來； (D)利用棒曲霉素核酸適體-棒曲霉素結(jié)合體不能誘導銀離子還原成近紅外熒光銀納米簇，只有單鏈信號探針ssDNA能夠誘導銀離子還原生成強熒光的近紅外銀納米簇的原理，檢測體系熒光強度，從而測定待測樣品中的真菌毒素棒曲霉素的含量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棒曲霉素的檢測方法，其特征是，所述棒曲霉素核酸適體為5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACTGATATTTTACCTTGACTATCAGTCGTGC-3’。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的棒曲霉素的檢測方法，其特征是，所述的單鏈信號探針ssDNA為5 ’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3’。4.一種檢測棒曲霉素的試劑盒，其特征是，其至少包括:棒曲霉素核酸適體、單鏈信號探針DNA、DNA擴增體系、外切酶、銀離子還原檢測體系。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測棒曲霉素的試劑盒，其特征是，所述棒曲霉素核酸適體為5，-CAGCTCAGAAGCTTGATCCCGGCCCGCCAACCCGCATCATCTACACTGATATTTTACCTTGACTATCAGTCGTGC-3’。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測棒曲霉素的試劑盒，其特征是，所述的單鏈信號探針DNA為5，-CCCCCCACACCCGATCCCCCCGCACGACTGATAGTC-3，。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測棒曲霉素的試劑盒，其特征是，所述DNA擴增體系包括緩沖溶液，緩沖溶液由Tris-HCl、MgCl2和(NH4)2SO4組成，三磷酸脫氧單核苷酸混合溶液dNTP和Phi29 DNA 聚合酶。8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測棒曲霉素的試劑盒，其特征是，所述核酸外切酶為ExoIII核酸外切酶。9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測棒曲霉素的試劑盒，其特征是，所述的銀離子還原檢測體系中的還原劑為抗壞血酸。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測棒曲霉素的方法及試劑盒，該方法包括如下步驟：（A）使棒曲霉素核酸適體（Apt）單鏈信號探針DNA（ssDNA）雜交，形成雜交鏈；（B）使該雜交鏈與待測樣品反應，當待測樣品中有棒曲霉素存在時，雜交鏈與棒曲霉素反應釋放出單鏈信號探針ssDNA；（C）利用DNA擴增，使雜交鏈成雙鏈DNA，然后用外切酶選擇性地催化雙鏈DNA水解成單核苷酸，體系中單鏈信號探針ssDNA未水解而保留下來；（D）在ssDNA誘導下，銀離子還原生成近紅外熒光銀納米簇；檢測體系熒光強度，從而測定待測樣品中的棒曲霉素的含量。該方法具有高靈敏度，操作簡單，低成本等特點。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105543375
【申請?zhí)枴緾N201610043724
【發(fā)明人】曾云龍, 符方芬, 鄧克勤, 楊凡, 黃昊文, 唐春然
【申請人】湖南科技大學
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月24日