用于普通野生稻遺傳完整性分析的引物組合及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及遺傳完整性分析引物，具體地說，設(shè)及用于普通野生稻遺傳完整性分 析的SSR分子標(biāo)記核屯、引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 普通野生稻是栽培稻的近緣祖先種，蘊藏著大量優(yōu)良基因資源，其親和性好，雜交 結(jié)實率高，是栽培稻育種的珍貴基因資源。普通野生稻是我國野生稻中分布最廣的一個種， 然而，近幾十年來，由于環(huán)境破壞等原因，其分布面積極大退化。普通野生稻種質(zhì)資源保護 的主要方式包括：原生境保護、種質(zhì)圃保護和種質(zhì)庫保存種子。其保護保存的目標(biāo)十分明 確:保持其遺傳完整性和多樣性。
[0003] 種質(zhì)遺傳完整性是指種質(zhì)原始遺傳組成狀態(tài)。種質(zhì)資源保護和保存需要保證在保 存和繁殖更新過程中群體的遺傳結(jié)構(gòu)得到完全的保持，包括基因型頻率及等位基因頻率等 與原始群體保持一致。因此準(zhǔn)確評價種質(zhì)的遺傳完整性具有重要的理論和實踐意義。
[0004] 因此，亟需獲得可用于普通野生稻遺傳完整性分析的SSR核屯、引物，并建立普通野 生稻遺傳完整性分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種用于普通野生稻遺傳 完整性分析的引物組合及其應(yīng)用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供一套用于普通野生稻遺傳完整性分析的SSR核屯、引物組合與方法，所 述方法是基于SSR分子標(biāo)記原理，采用經(jīng)過前期大量篩選工作所獲得的25對多態(tài)性核屯、引 物，對90~160個單株的普通野生稻基因組DNA進行擴增，利用生物分析軟件統(tǒng)計分析群體 的遺傳多樣性指數(shù)，反映群體的遺傳完整性保持情況。
[000引第一方面，本發(fā)明提供用于普通野生稻遺傳完整性分析的引物組合，其由如下25 個引物對組成：
[0009] SSR01:正向引物如沈Q ID NO. 1所示;反向引物如沈Q ID NO.2所示； [0010]55302:正向引物如沈9 10^.3所示;反向引物沈9 10^.4所示；
[0011] SSR03:正向引物如沈Q ID NO.5所示;反向引物如沈Q ID NO.6所示；
[0012] SSR04:正向引物如沈Q ID NO.7所示;反向引物如沈Q ID NO.8所示；
[0013] SSR05:正向引物如沈Q ID NO.9所示;反向引物如沈Q ID NO. 10所示；
[0014] SSR06:正向引物如沈Q ID NO. 11所示;反向引物如沈Q ID NO. 12所示；
[0015] SSR07:正向引物如沈Q ID NO.13所示;反向引物如沈Q ID NO.14所示；
[0016] SSR08:正向引物如沈Q ID NO. 15所示;反向引物如沈Q ID NO. 16所示；
[0017] SSR09:正向引物如沈Q ID NO. 17所示;反向引物如沈Q ID NO. 18所示；
[001引 SSR10:正向引物如沈Q ID NO. 19所示;反向引物如沈Q ID NO.20所示；
[0019] SSRll:正向引物如沈Q ID NO.21所示;反向引物如沈Q ID NO.22所示；
[0020] SSR12:正向引物如沈Q ID NO.23所示;反向引物如沈Q ID NO.24所示；
[0021] SSR13:正向引物如沈Q ID NO.25所示;反向引物如沈Q ID NO.26所示；
[0022] SSR14:正向引物如沈Q ID NO.27所示;反向引物如沈Q ID NO.28所示；
[0023] SSR15:正向引物如沈Q ID NO.29所示;反向引物如沈Q ID NO.30所示；
[0024] SSR16:正向引物如沈Q ID NO.31所示;反向引物如沈Q ID NO.32所示。
[0025] SSR17:正向引物如沈Q ID NO.33所示;反向引物如沈Q ID NO.34所示。
[0026] SSR18:正向引物如沈Q ID NO.35所示;反向引物如沈Q ID NO.36所示。
[0027] SSR19:正向引物如沈Q ID NO.37所示;反向引物如沈Q ID NO.38所示。
[002引 SSR20:正向引物如沈Q ID NO.39所示;反向引物如沈Q ID NO.40所示。
[0029] SSR21:正向引物如沈Q ID NO.41所示;反向引物如沈Q ID NO.42所示。
[0030] SSR22:正向引物如沈Q ID NO.43所示;反向引物如沈Q ID NO.44所示。
[0031] SSR23:正向引物如沈Q ID NO.45所示;反向引物如沈Q ID NO.46所示。
[0032] SSR24:正向引物如沈Q ID NO.47所示;反向引物如沈Q ID NO.48所示。
[0033] SSR25:正向引物如沈Q ID NO.49所示;反向引物如沈Q ID NO.50所示。
[0034] 上述25對核屯、引物是從550對SSR引物中，經(jīng)篩選獲得。引物篩選方法為，W160個 單株的江西東鄉(xiāng)普通野生稻DNA為模板，分別用550對SSR引物進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)聚丙締 酷胺凝膠電泳、凝膠銀染、統(tǒng)計擴增結(jié)果。針對每對引物在160個單株中的擴增結(jié)果，剔除不 具備多態(tài)性的引物，保留具有多態(tài)性的引物，最終篩選獲得25對多態(tài)性核屯、引物。篩選得到 的引物相對未被選擇引物，在體現(xiàn)種質(zhì)的遺傳多樣性方面具有明顯優(yōu)勢。
[0035] 第二方面，在上述引物組合存在的前提下，任何含有該引物組合的產(chǎn)品均在本發(fā) 明的保護范圍內(nèi)，例如含有上述引物組合的試劑或試劑盒。原因在于，其在應(yīng)用時利用的是 本發(fā)明所述引物組合的特殊性，且得到的結(jié)果取決于本發(fā)明所述引物組合的特殊性。
[0036] 第Ξ方面，本發(fā)明提供前述引物組合在分析普通野生稻遺傳完整性方面的應(yīng)用。 由于前述引物組合能夠針對普通野生稻的遺傳多樣性進行鑒定，所得結(jié)果可用于判斷種質(zhì) 遺傳完整性的保持情況。因此，本發(fā)明提供前述引物組合可用于普通野生稻遺傳完整性分 析。
[0037] 第四方面，本發(fā)明提供一種分析普通野生稻遺傳完整性的方法，W待分析樣本的 基因組DNA為模板，利用前述引物組合進行PCR擴增，經(jīng)聚丙締酷胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物， 利用生物學(xué)軟件對電泳結(jié)果進行遺傳結(jié)構(gòu)分析。
[0038] 進一步地，所述待分析樣本的樣本量(群體量)為90~160。原因在于，經(jīng)實驗統(tǒng)計 發(fā)現(xiàn)，群體量越小，特異性單株平均頻率越低，其標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)很大，表明采用過小 的群體量，取樣誤差十分明顯。群體量增加至90單株時，特異單株頻率逐步穩(wěn)定趨近10%， 變異系數(shù)控制在15% W內(nèi)，基本可W代表160單株的多樣性。因此在進行普通野生稻遺傳完 整性分析時，需要保證90株W上的群體量。
[0039] 作為優(yōu)選，所述基因組DNA提取自普通野生稻植株葉片，因幼嫩葉片中次生代謝物 質(zhì)含量低，易于獲得高質(zhì)量DNA，優(yōu)選幼嫩葉片。
[0040] 優(yōu)選地，所述種子來自江西東鄉(xiāng)普通野生稻。
[0041] 作為優(yōu)選，為了更好的觀察擴增結(jié)果，可采用6%聚丙締酷氨凝膠電泳分離擴增產(chǎn) 物，電泳結(jié)束后采用銀染法染色。
[0042] 更進一步地，所述PCR擴增的反應(yīng)體系為：10 X PCR緩沖液(含Mgh) 2.0化，2.5mmol/ L dNTP 1.5yL，5UAiL Taq 0.化L，化mol/L SSR引物2.0yL，20ng/yL DM 2.0化，d加 2〇 12.0化。
[0043] 所述PCR擴增的程序為：94°C預(yù)變性5min; 95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 lmin，38個循環(huán);72°C延伸lOmin。待溫度降至10°C后，于4°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?br>[0044] 基于上述優(yōu)選方案，本發(fā)明提供一個完整具體的實施方式，包括如下步驟：
[0045] (1)采用CTAB法提取普通野生稻待分析樣本葉片的基因組DNA，樣本為90~160單 株稻；
[0046] (2) W步驟(1)提取的DNA為模板，用前述引物組合進行PCR擴增；
[0047] (3)采用6%聚丙締酷氨凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行分離，電泳結(jié)束后采用銀染法染 色；
[0048] (4)利用生物學(xué)軟件分析電泳結(jié)果。
[0049] 其中，所述步驟(4)具體為：統(tǒng)計擴增譜帶類型，參照DNA marker(pBR322)估計片 段大小。使用P0PGE肥等軟件對不同普通野生稻種質(zhì)群體進行遺傳結(jié)構(gòu)分析，比較不同種質(zhì) 等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)等指標(biāo)。采用SPSS或SAS等軟件， 分析群體間各指數(shù)差異，若無顯著差異則認(rèn)為群體遺傳完整性得到有效保持，若差異達到 顯著水平，則認(rèn)為群體遺傳完整性發(fā)生了改變。
[0050] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0051] 本發(fā)明W江西東鄉(xiāng)普通野生稻為材料，通過大量實驗研究，篩選出了一批可用于 普通野生稻遺傳完整性分析的SSR核屯、引物，建立了用于普通野生稻遺傳完整性分析的引 物組合，并基于此，建立了分析方法。
[0052] 本發(fā)明提供的分析方法適用于普通野生稻種質(zhì)遺傳完整性的分析。所篩選的引物 組合和最少90個單株的群體量，為準(zhǔn)確分析普通野生稻種質(zhì)保存和繁殖更新過程中遺傳完 整性檢測提供了標(biāo)準(zhǔn)方法。
【附圖說明】
[0053] 圖1為本發(fā)明實施例1中引物SSR16對部分單株普通野生稻的擴增結(jié)果。左起第5泳 道為Marker，其它泳道為野生稻單株DNA擴增結(jié)果。
[0054] 圖2為本發(fā)明實施例1中不同大小群體量多態(tài)性單株差異。
【具體實施方式】
[0055] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細(xì)說明。需要理解的是W下實 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可W對本發(fā)明進行各種修改和替換。
[0056] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0057] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[005引實施例1普通野生稻種質(zhì)的遺傳完整性分析
[0化9] 1.實驗材料
[0060] w江西東鄉(xiāng)普通野生稻為試材，取一定量種子育苗后移栽至大田進行常規(guī)管理。 隨機選取160個單株，取其幼嫩葉片，-20°c凍存?zhèn)溆谩?br>[0061 ] 2.基因組DNA提取:采用CTAB法分別提取160個單株葉片的基因組DNA。
[0062] 3.引物合成及篩選
[0063] (1)合成引物：參考水稻SSR引物序列，隨機選擇550對引物，經(jīng)生工生物工程（上 海)股份有限公司合成引物。
[0064] (2)引物篩選:采用160個單株DNA模板，利用全部550對引物進行擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng) 聚丙締酷胺凝膠電泳、凝膠銀染，根據(jù)擴增結(jié)果，剔除不具多態(tài)性的引物，共篩選出25對特 異多態(tài)性引物，其中引物SSR16的擴增結(jié)果見圖1，引物的序列信息見表1:
[0065] 表1普通野生稻SSR特異多態(tài)性引物序列
[0066]
[0067] (3)適宜樣本量：W引物SSR16的擴增結(jié)果為例，160單株中有128單株的擴增結(jié)果 完全一樣(主帶型），另外32單株DNA擴增結(jié)果與主帶型不同，將運些單株稱為特異單株，如 圖1中左起第1、2、7和9等泳道。160單株群體量中，特異單株頻率為20%。將160株群體隨機 分成10株、20株......150株不同大小群體，統(tǒng)計每個群體量特異性單株頻率，統(tǒng)計20次計 算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著群體量增加特異性單株頻率逐漸增加（圖 2)。群體量越小，特異性單株平均頻率越低，其標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)很大，表明采用過小的 群體量，取樣誤差十分明顯。群體量增加至90單株時，特異單株頻率逐步穩(wěn)定趨近20%，變 異系數(shù)控制在15% W內(nèi)，基本可W代表160單株的多樣性。因此認(rèn)為進行普通野生稻遺傳完 整性分析時，需要保證90株W上的群體量。
[0068] 實施例2不同生活力群體普通野生稻種質(zhì)的遺傳完整性分析
[0069] 1.實驗材料
[0070] W江西東鄉(xiāng)普通野生稻為試材。采集普通野生稻種子，采用高溫高濕方法老化種 子獲得不同發(fā)芽率的群體(具體見表2)，每個群體取一定量種子育苗后移栽至大田進行常 規(guī)管理。每個群體隨機選取160個單株，取其幼嫩葉片，-20°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0071] 2.基因組DNA提取:采用CTAB法分別提取160個單株葉片的基因組DNA。
[0072] 3.不同生活力群體遺傳完整性比