一種玉米小斑病病原物的快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種特異性引物快速檢測(cè)病原物的方法，具 體設(shè)及一種快速檢測(cè)玉米小斑病的特異性引物及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米小斑病菌為半知菌類、平廝蠕抱菌屬、玉蜀泰平廝蠕抱菌，學(xué)名為:Bipolaris maydis(Nisikadoe Τ Miyake)Shoem，異名為：Helminthosporium maydis Nisikadoe TMiyake，Drechslera maydis(Nisikado et Miyake)Subram&Jain。有性態(tài)為異旋抱腔菌 Cochl iobolus heterostrophus(Drechsler)Drechsler，異名為：0phiobolus Heterostro地us Drechsler。該菌子囊座呈黑色，近球形，357-642 X 276-443(皿），子囊頂 端純圓，基部具短柄，大小124-183Χ23-29(μπι)。每個(gè)子囊內(nèi)的子囊抱子數(shù)目不等，一般為 Ξ個(gè)左右，子囊抱子呈長(zhǎng)線形，約7.3 X 6.3-8.8(μπι)大小。無(wú)性態(tài)的分生抱子梗散生在病葉 上的病斑兩側(cè)，從表皮細(xì)胞或葉片組織的氣孔伸出，單生或者束生，攬褐色至褐色，伸直或 彎曲，基部細(xì)胞大，頂端略細(xì)且顏色較淺，下部色深較粗，抱痕明顯，生在頂點(diǎn)或折點(diǎn)上，一 般有6至8個(gè)隔膜，大小80~156X5~10(μπι)。分生抱子從抱子梗的頂端或側(cè)方生出，長(zhǎng)楠圓 形，多彎向一側(cè)具隔，廝點(diǎn)平截。
[0003] 該病原菌能夠引起玉米小斑病，是廣泛發(fā)生于玉米產(chǎn)區(qū)的一種較為嚴(yán)重的葉部病 害。二十世紀(jì)20年代我國(guó)著名植物病理學(xué)家俞大級(jí)在江浙地區(qū)發(fā)現(xiàn)此病，并于1933年對(duì)該 病進(jìn)行了詳細(xì)深入的報(bào)道。上世紀(jì)70年代美國(guó)玉米小斑病大流行W來(lái)，玉米小斑病在世界 各國(guó)玉米產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，成為玉米上主要病害之一，每年都會(huì)造成一定的產(chǎn)量損失。因此， 盡早快速的檢測(cè)該病原菌對(duì)減輕該病害造成的損失具有重要的意義。目前平廝蠕抱類病菌 的分類和鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征、致病性測(cè)定等。傳統(tǒng)的病菌鑒別方法耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低 W及經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)，發(fā)病植株中分離并鑒定病原菌需要數(shù)天時(shí)間，難W做到對(duì)病害發(fā)生的及時(shí) 監(jiān)測(cè)和有效控制病原菌的傳播與病害流行。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，不同分子技術(shù)用于植 物蠕抱類病害的檢測(cè)。通過(guò)比對(duì)所測(cè)序的玉蜀泰平廝蠕抱菌與GenBank中平廝蠕抱屬中其 它幾個(gè)種的EF-la基因的部分序列，利用DNAMAN設(shè)計(jì)出了可用于檢測(cè)玉蜀泰平廝蠕抱菌的 特異性引物，為從玉米葉片中快速、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)玉蜀泰平廝蠕抱菌潛伏侵染與否奠定了基礎(chǔ)， 有利于及早有效的采取防治措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：玉米小斑病菌能夠引起玉米小斑病，是廣泛發(fā)生于 玉米產(chǎn)區(qū)的一種較為嚴(yán)重的葉部病害，每年都會(huì)造成一定的產(chǎn)量損失。因此，盡早快速的檢 測(cè)該病原菌對(duì)減輕該病害造成的損失具有重要的意義，本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)玉米小斑 病的特異性引物及使用方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0006] -種玉米小斑病病原物的快速檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括W下步驟：
[0007] (1)真菌菌絲的收集；
[000引（2)真菌DNA的提??；
[0009] (3)PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為，正向引物X-EF和反向引物X-ER各化L，DNA模板化L， Taq PCR Master Mix 12.扣L，d地2〇補(bǔ)至反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min;94°C變性 30s、52.9°C 退火 30s、72°C 延伸 30s，共 32 個(gè)循環(huán);72°C 延伸 lOmin，4°C 保存。 [0010]所述正向引物《-6尸序列如沈9 10^:1所示，反向引物乂斗3序列如沈9 10^:2所 /J、- 〇
[0011] 所述正向引物和反向引物的濃度為扣molAiL，DNA模板濃度為25ngAiL，Taq PCR Master Mix購(gòu)自上海萊楓生物科技有限公司，所述Taq PCR Master Mix含有0.化/μL Taq DNA polymerase，0.4mM each dNTP，2XTaq Buffer,PCR增強(qiáng)劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
[0012] 一種玉米小斑病的快速檢測(cè)方法作為玉米葉片中小斑病病原菌早期監(jiān)測(cè)的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的有益效果是:為從玉米葉片中快速、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)玉蜀泰平廝蠕抱菌潛伏侵 染與否提供依據(jù)，有利于及早有效的采取防治措施。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為玉米小斑病單重PCR引物特異性檢測(cè)圖，其中1: (ZM09358)，2: (ZM10094-2)， 3：(ZM10233-3),4：(09316-5),5：(ZM09313-2-1),6：(ZM10321),7：(ZM10599),8：(ZMLC025- 2),9：(ZM10322-3),10：(ZM10587-2),11：(ZTY030032),12：(ZM10239-1),13：(ZM09362-2), 14:(DH020637)，15:(ZM10601)，16:(ZM10602)，17:(ZM10603)，18:(ZM10604)，19: (ZM10605)，CK:空白對(duì)照，Μ: DL2000Marker;
[001引圖2為玉米小斑病引物靈敏度的檢測(cè)圖，其中Μ為分子標(biāo)量DL1000;CK為陰性對(duì)照； 泳道 1-12 分別是在 25化的體系中含有 long、Ing、lOOpg、lOpg、Ipg、lOOfg、lOfg、Ifg、lOOag、 10ag、lag、0.1ag DNA量的擴(kuò)增結(jié)果；
[0016] 圖3為玉米發(fā)病葉片的檢測(cè)，Μ為分子標(biāo)量化2000的marker ;CK為陰性對(duì)照；泳道1 為健康的玉米葉片提取DNA擴(kuò)增結(jié)果;泳道2為發(fā)病玉米葉片提取DNA擴(kuò)增結(jié)果;泳道3為陽(yáng) 性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0017] -種玉米小斑病病原物的快速檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括W下步驟：
[001引（1)真菌菌絲的收集；
[0019] (2)真菌DNA的提?。?br>[0020] (3)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。
[0021] 所述正向引物X-EF序列如沈QIDN0:1所示，反向引物X-ER序列如沈QIDN0:2所 /J、- 〇
[0022] 一種玉米小斑病的快速檢測(cè)方法作為玉米葉片中小斑病病原菌早期監(jiān)測(cè)的應(yīng)用， 具體步驟如下：
[0023] -、真菌菌絲的收集
[0024] 取保存的菌株(見(jiàn)附表一)接種于PDA平板上，25°C下生長(zhǎng)3天，挑新鮮菌絲，接種于 裝有體積PDB的250mLS角瓶中。25°C12化/min,培養(yǎng)3-4天，至生成大量菌絲團(tuán)為止。雙
[0026] 層紗布過(guò)濾，蒸饋水連續(xù)沖洗，濾紙吸干水分，置于1.5mL離屯、管-20°c保存?zhèn)溆谩0025] 表一供試菌株的來(lái)源及編號(hào)
[0027]
[002引二、真菌DNA的提取
[0029] 采用改進(jìn)的CTAB法提取真菌菌絲DNA，具體步驟如下：
[0030] (1)取適量的菌絲（約0.5g)于研鉢中，加液氮快速磨成粉末（至少加液氮研磨3 次)；
[0031] (2)將樣品粉末用滅菌的藥匙轉(zhuǎn)移到1.5mL的離屯、管中，加700化在65°C水浴鍋中 預(yù)熱的CTAB提取緩沖液，然后將離屯、管放在65°C的恒溫水浴中保持45min，每隔lOmin輕輕 的顛倒幾次，使粉末和緩沖液混合均勻；
[0032] (3)12000巧m，4°C 離屯、lOmin，吸取上清液；
[0033] (4)加入70化L抽提液I (苯酪:氯仿：異戊醇=25 :24:1 )，輕輕顛倒數(shù)次至溶液混 勻；
[0034] (5)12000巧m，4°C 離屯、lOmin，吸取上清液；
[0035] (6)加入70化L抽提液I，輕輕顛倒數(shù)次至溶液混勻；
[0036] (7)12000巧m，4°C 離屯、lOmin，吸取上清液；
[0037] (8)加入60化L抽提液Π (氯仿:異戊醇=24:1)，反復(fù)混勻；
[003引 （9)12000巧m，4°C離屯、lOmin，吸取上清液；
[0039] (10)加入6(K)yL預(yù)冷的異丙醇，輕輕搖勻，放在冰上30min;
[0040] (11)棄上清，并加入60化1 70%的乙醇洗涂沉淀兩次；
[0041] (12)置于無(wú)菌操作臺(tái)上，吹干(約20min);
[0042 ] (13)加入20-200yLdd出 0，溶解DNA;
[0043] (14)使用分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，并將濃度調(diào)整為約l(K)ngAik20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0044] S、PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0045] (1)單重PCR反應(yīng)體系：Taq PCR Master Mix(含0.化/μL Taq DNA polymerase, 0.4mM each dNTP，2XTaq Buffer，PCR增強(qiáng)劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑）12.扣L，正向引物X-EF(扣 mol)和反向引物X-ER( 5皿〇1)各化L，DNA模板（25ngAiLHyL，d地2〇補(bǔ)至化化。
[0046] (2 )PCR 反應(yīng)條件:94°C 預(yù)變性 3min; 94°C 變性 30s、52.9°C 退火 30s、72°C 延伸 30s， 共32個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmin;擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及υν?凝膠成像系統(tǒng)分 析結(jié)果(見(jiàn)圖1)。由圖二可知只有玉米小斑病的病原物跑出了205bp的條帶，其它菌株均未 跑出條帶。
[0047] 四、引物靈敏度檢測(cè)
[004引將原有玉米小斑病的基因組DNA從long/化開(kāi)始稀釋10倍得到12個(gè)處理（1、10-1、 ιοΛ ιοΛ 10-5、ιοΛ ιοΛ ιοΛ ιοΛ i0-w)，采用優(yōu)化好的擴(kuò)增體系及程序，分別擴(kuò)增，檢測(cè)， 結(jié)果如圖Ξ所示。由圖2可知，lOng-lng(稀釋10倍)均能擴(kuò)增出清晰的PCR條帶(泳道1、2)， 而稀釋100倍、1000倍后擴(kuò)增的條帶也隱約可見(jiàn)(泳道3、4);說(shuō)明此方法對(duì)玉米小斑病檢測(cè) 的靈敏度非常高，約為lOpg/yL，可見(jiàn)該方法可靠。
[0049] 五、發(fā)病植株組織中病菌的快速檢測(cè)
[0050] 為了驗(yàn)證能否從玉米病組織中檢測(cè)到玉米小斑病的病原菌，用玉蜀泰平廝蠕抱接 種健康的玉米葉片，模擬玉米小斑病病原菌的自然侵染，接種發(fā)病后進(jìn)行病原菌檢測(cè)。W接 種發(fā)病的玉米葉片組織總DNA為模板，利用引物X-EF/X-ER進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同樣可W擴(kuò)增出 205bp的特異性片段，而健康玉米葉片組織DNA未能擴(kuò)增出特異性條帶（圖3)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種玉米小斑病病原物的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法包括以下步驟： (1) 真菌菌絲的收集； (2) 真菌DNA的提?。? (3 )PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為，正向引物X-EF和反向引物X-ER各lyL，DNA模板lyL，Taq PCR Master Mix 12.5yL，ddH20補(bǔ)至25yL;PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min;94°C變性30s、 52.9°C退火30s、72°C延伸30s，共32個(gè)循環(huán);72°C延伸lOmin，4°C保存。2. 如權(quán)利要求1所述的玉米小斑病病原物的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述正向引物 X-EF序列如SEQIDNO:l所示，反向引物X-ER序列如SEQIDNO:2所示。3. 如權(quán)利要求1所述的玉米小斑病病原物的快速檢測(cè)方法，其特征在于，所述正向引物 和反向引物的濃度為5ymol/yL，DNA模板濃度為25ng/yL。4. 一種玉米小斑病的快速檢測(cè)方法作為玉米葉片中小斑病病原菌早期監(jiān)測(cè)的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種特異性引物快速檢測(cè)病原物的方法，具體涉及一種快速檢測(cè)玉米小斑病的特異性引物及其檢測(cè)方法。一種玉米小斑病病原物的快速檢測(cè)方法，包括（1）真菌菌絲的收集；（2）真菌DNA的提?。唬?）PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系為，正向引物X-EF和反向引物X-ER各1μL，DNA模板1μL，Taq？PCR？Master？Mix？12.5μL，ddH2O補(bǔ)至25μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s、52.9℃退火30s、72℃延伸30s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。為從玉米葉片中快速、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)玉蜀黍平臍蠕孢菌潛伏侵染與否提供依據(jù)，有利于及早有效的采取防治措施。
【IPC分類】C12Q1/04, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105543382
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610058100
【發(fā)明人】張猛, 馬慶周, 耿月華, 武海燕, 于思勤
【申請(qǐng)人】河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月28日