一種評價轉(zhuǎn)GmDREB1抗逆小麥非預期效應的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及評價轉(zhuǎn)GmDREBI抗逆小麥非預期效應的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)廣泛用于農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)，通過將外源基因引入，很多作物可W 提高其產(chǎn)量、抗逆性、營養(yǎng)成分等。盡管到目前為止，一直沒有檢測到由于種植轉(zhuǎn)基因作物 或者消費轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品而帶來的非預期的不良效應，但從轉(zhuǎn)基因作物來源的食品卻經(jīng)常收到 人們的貶低，其部分原因是人們擔屯、轉(zhuǎn)基因食品可能存在非預期不良效應，會給人類健康 帶來危害。非預期效應可能會由外源基因表達產(chǎn)生的次級或者其它多重效應引起，也可能 由于外源基因引入到植物基因組的插入效應引起。外源基因插入植物基因組是一個隨機的 過程，該過程可能引起的非預期效應包括:物理性破壞，修飾或者沉默某些基因，失活內(nèi)源 基因，激活沉默基因，形成融合蛋白，調(diào)控其它基因或者生物化學過程等。
[0003] 非生物逆境脅迫的抗逆性遠比現(xiàn)在已經(jīng)商業(yè)化的性狀，如抗蟲、抗除草劑等性狀 要復雜的多，因為植物抗逆可能設(shè)及很多基因、設(shè)及幾個信號傳導途徑、或者多個逆境相關(guān) 蛋白和酶等?？鼓嫘誀畹膹碗s性可能會增加抗逆轉(zhuǎn)基因植物非預期效益發(fā)生的可能性。因 DREB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控系列重要的逆境響應基因的表達，它在提高植物抗逆性研究方面?zhèn)涫荜P(guān) 注并取得了很大的進展。自從DRE順式作用原件首次從擬南芥發(fā)現(xiàn)W來，已從20多類植物中 發(fā)現(xiàn)40多個DR邸基因。應對逆境脅迫，DR邸基因調(diào)控下游系列逆境相關(guān)基因，形成復雜的調(diào) 控網(wǎng)絡(luò)。但不同的DREB基因，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的成員并不相同，轉(zhuǎn)DREB基因的轉(zhuǎn)基因植物，其抗 逆效果也各不相同。所W外源DREB基因的引入和表達非常復雜，轉(zhuǎn)DR邸基因的抗逆轉(zhuǎn)基因 植物的非預期效應的檢測非常重要和必要，且具有個案特點。
[0004] 關(guān)于非預期效益的檢測方法，目前應用比較廣泛的是組學的方法，如基因組，轉(zhuǎn)錄 組，蛋白質(zhì)組，代謝組等。組學的方法對分子表達譜的分析更具有整體性和綜合性，運就增 加了檢測到非預期效應的可能性。在轉(zhuǎn)基因擬南芥、水稻、玉米、大豆、西紅柿、±豆、大麥 (優(yōu)質(zhì)）、小麥等作物的非預期效應評價中都有應用。
[0005] 雖然小麥是第二大糧食作物，隨著環(huán)境不斷惡化，抗逆小麥需求不斷加大，抗逆轉(zhuǎn) 基因小麥的研究也有了很大的進展，但抗逆轉(zhuǎn)基因小麥的非預期效應評價還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明一個目的是提供一種評價抗逆性轉(zhuǎn)GmDREBI植物是否具有非預期效應的方 法。
[0007] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：
[000引1 )、對正常條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)GmDREBI植物、逆境條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)GmDREBI植物、正常條件 下培養(yǎng)受體植物和逆境條件下培養(yǎng)受體植物進行RNA-seq測序分析，得到正常條件下培養(yǎng) 轉(zhuǎn)GmDREBI植物表達基因譜、逆境條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)GmDREBI植物表達基因譜、正常條件下培養(yǎng) 受體植物表達基因譜和逆境條件下培養(yǎng)受體植物表達基因譜；
[0009] 2)、比較所述正常條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)GmDREBl植物表達基因譜和所述逆境條件下培養(yǎng) 轉(zhuǎn)GmDREBl植物表達基因譜，有差異的表達基因，記作轉(zhuǎn)GmDREBl植物環(huán)境效應引起的差異 表達基因組；
[0010] 比較所述正常條件下培養(yǎng)受體植物表達基因譜和所述逆境條件下培養(yǎng)受體植物 表達基因譜，有差異的表達基因，記作受體植物環(huán)境效應引起的差異表達基因組；
[0011] 比較所述正常條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)G血REB1植物表達基因譜和在所述正常條件下培養(yǎng)受 體植物表達基因譜，有差異的表達基因，記作正常環(huán)境轉(zhuǎn)GmDREBl植物轉(zhuǎn)基因效應差異表達 基因組；
[0012] 比較所述逆境條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)G血REB1植物表達基因譜和所述逆境條件下培養(yǎng)受體 植物表達基因譜，有差異的表達基因，記作逆境環(huán)境轉(zhuǎn)G血REB1植物轉(zhuǎn)基因效應差異表達基 因組；
[0013] 由所述轉(zhuǎn)GmDREBl植物環(huán)境效應引起的差異表達基因組和所述受體植物環(huán)境效應 引起的差異表達基因組組成環(huán)境效應引起的差異表達基因譜；
[0014] 由所述正常環(huán)境轉(zhuǎn)GmDREBl植物轉(zhuǎn)基因效應差異表達基因組和所述逆境環(huán)境轉(zhuǎn) GmDREBl植物轉(zhuǎn)基因效應差異表達基因組組成轉(zhuǎn)基因效應相關(guān)差異表達基因譜；
[0015] 比對所述轉(zhuǎn)基因效應相關(guān)差異表達基因譜和所述環(huán)境效應引起的差異表達基因 譜，選取二者的差異表達基因且隸屬于所述轉(zhuǎn)基因效應相關(guān)差異表達基因譜的基因，記作 轉(zhuǎn)基因效應引起的特異差異表達基因；
[0016] 比對所述轉(zhuǎn)GmDREBl植物環(huán)境效應引起的差異表達基因組和所述受體植物環(huán)境效 應引起的差異表達基因組:將種類相同的差異表達基因記作逆境脅迫下所述轉(zhuǎn)GmDREBl植 物和所述受體植物共同差異表達基因組;將種類不相同且隸屬于所述受體植物環(huán)境效應引 起的差異表達基因組的差異表達基因，記作逆境脅迫下所述受體植物單獨變化的環(huán)境效應 引起差異表達基因組;將種類不相同且隸屬于所述轉(zhuǎn)GmDREBl植物環(huán)境效應引起的差異表 達基因的差異表達基因，記作逆境脅迫下所述轉(zhuǎn)GmDREBl植物單獨變化的環(huán)境效應引起差 異表達基因組；
[0017] 3)分析所述轉(zhuǎn)基因效應引起的特異差異表達基因、所述逆境脅迫下轉(zhuǎn)GmDR邸1植 物和受體植物共同差異表達基因組、所逆境脅迫下受體植物單獨變化的環(huán)境效應引起差異 表達基因組、所述逆境脅迫下轉(zhuǎn)GmDREBl植物單獨變化的環(huán)境效應引起差異表達基因組，
[0018] 若滿足如下A或A+化C，則所述轉(zhuǎn)GmDREBl植物存在非預期效應；
[0019] 若不滿足A或A+化C，則所述轉(zhuǎn)GmDREBl植物不存在非預期效應；
[0020] 所述A為轉(zhuǎn)基因效應引起的特異差異表達基因在轉(zhuǎn)GmDR邸1植物和受體植物之間 存在差異表達且該轉(zhuǎn)基因效應引起的特異差異表達基因與致敏因子或毒性因子的產(chǎn)生相 關(guān)：
[0021] 所述B為從逆境脅迫下轉(zhuǎn)GmDR邸1植物和受體植物共同差異表達基因組中選取在 逆境脅迫下在轉(zhuǎn)GmDREBl植物和受體植物為同一表達模式且表達倍數(shù)不同的差異基因的功 能與抗逆無關(guān)，且能引起致敏或毒性因子的產(chǎn)生；
[0022] 同一表達模式為如下1)或2):
[0023] 1)共同差異表達基因組中的某基因在受到逆境脅迫后在轉(zhuǎn)基因植物中的表達為 上調(diào)，且在受到逆境脅迫后在受體植物中的表達為上調(diào)；
[0024] 2)共同差異表達基因組中的某基因在受到逆境脅迫后在轉(zhuǎn)基因植物中的表達為 下調(diào)，且在受到逆境脅迫后在受體植物中的表達為下調(diào)。
[0025] 所述C為所述逆境脅迫下轉(zhuǎn)GmDR邸1植物單獨變化的差異表達基因組和所述逆境 脅迫下所述受體植物單獨變化的差異表達基因組所有基因中至少一個基因的功能與抗逆 無關(guān)，且能引起致敏或毒性因子的產(chǎn)生。
[00%]上述方法中，
[0027] 步驟2)中，所述比較用火山圖展示或DESeq;
[0028] 所述比對采用Ven圖分析；
[0029] 所述檢測基因是否與抗逆無關(guān)采用GO功能分析；
[0030] 所述檢測基因是否能引起致敏或毒性因子的產(chǎn)生采用GO功能分析或比對致敏因 子或毒性因子數(shù)據(jù)庫；
[0031] 所述A中轉(zhuǎn)基因效應引起的特異差異表達基因在轉(zhuǎn)GmDR邸1植物和受體植物之間 存在差異表達是通過巧光定量PCR和半定量PCR確定。
[0032] 上述方法中，
[0033] 所述抗逆性為抗鹽性；
[0034] 所述逆境脅迫為鹽脅迫。
[0035] 上述方法中，
[0036] 所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；
[0037] 所述轉(zhuǎn)GmDREBl植物為將GmDREBl基因（序列1)導入受體植物中得到的轉(zhuǎn)GmDREBl 植物。
[0038] 上述方法中，所述單子葉植物為小麥。
[0039] 本文中的術(shù)語和定義如下：
[0040] 轉(zhuǎn)基因植物:將外源基因?qū)胧荏w植物中得到的轉(zhuǎn)基因植物；
[0041 ] 轉(zhuǎn)基因受體Transgenic acceptor:與轉(zhuǎn)基因品種對應的轉(zhuǎn)基因受體品種。
[0042] 非預期效應化intended effects :由于外源基因轉(zhuǎn)入引起的預期之外的不良效 應，在本實施例中，非預期效應為GmDREBl基因?qū)胧荏w植物產(chǎn)生的非抗逆且為致敏或毒性 的效應。
[0043] 環(huán)境效應Effects of envircmment:由于環(huán)境變化引起的轉(zhuǎn)基因小麥與受體植物 之間的基因表達差異。
[0044] 轉(zhuǎn)基因效應Effects of single gene insedion:由于外源基因轉(zhuǎn)入引起的轉(zhuǎn)基 因小麥與受體植物之間的基因表達差異。
[0045] 逆境脅迫響應Stress response of plants:轉(zhuǎn)基因小麥或受體植物在某一逆境 條件下的基因表達變化。
[0046] 植物材料:轉(zhuǎn)基因抗逆小麥及其受體植物品種在正常生長條件及逆境條件下收獲 的種子。
[0047] 本發(fā)明的實驗證明，本研究選擇的轉(zhuǎn)GmDREBl基因的抗逆轉(zhuǎn)基因小麥T349,已經(jīng)報 道和受