對EGFRvIII有特異性的抗體結(jié)合位點的制作方法
【專利說明】對EGFRvI I I有特異性的抗體結(jié)合位點
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及特異性結(jié)合EGFRvII I的結(jié)合蛋白和特異性結(jié)合EGFRvH I和CD3的多特 異性結(jié)合蛋白。本發(fā)明進一步延伸到結(jié)合EGFRWII和CD3的多特異性串聯(lián)雙抗體（tandem diabody)。特別是，本發(fā)明設(shè)及用于募集T細胞W專口有效地殺死幾種類型實體瘤癌癥的高 細胞毒性EGFRvII I/CD3雙特異性串聯(lián)雙抗體(TandA b?)。
[0002] EGFR失調(diào)與許多癌癥相關(guān)聯(lián)，小分子和EGFR祀向抗體均已成功用于臨床。然而，由 于EGFR的廣泛的正常組織表達，被批準用于臨床應(yīng)用的抗體W及那些處于開發(fā)中的抗體均 具有嚴重的副作用。具有截短的胞外結(jié)構(gòu)域并確保配體非依賴性固有活性的EGFR的缺失突 變體(deletion variantHiKEGFRWII)，是與致癌性轉(zhuǎn)化相關(guān)的最常見的突變體形式。 EGFRvIII專口在癌組織中表達，并與各種實體瘤類型相關(guān)。癌細胞上受限制的EGFRvIII表 達提供了開發(fā)?？陟胂虬┌Y同時保護正常組織并充分降低與EGFR治療相關(guān)的副作用的細 胞毒性抗體的機會。
[0003] 在本發(fā)明的第一個方面中，本文描述了全人的、高特異性的、高親和力EGFRvin結(jié) 合蛋白。所描述的EGFRvIII結(jié)合蛋白具有如下優(yōu)勢：
[0004] 它們不促進或促進來自祀向陽性分子的細胞表面的非常低的EGFRvIII內(nèi)化，運有 利于募集細胞毒性T-細胞或NK-細胞。圖9中的結(jié)果顯示，根據(jù)本發(fā)明，細胞在所有測試條件 下暴露于EGFRWII結(jié)合蛋白之后，相對于未處理的細胞，EGFRWII受體分子仍保留在細胞 表面上。運些結(jié)果表明，本發(fā)明的EGFRVIII/CD3結(jié)合蛋白令人驚訝地不顯示任何內(nèi)化趨勢 (圖9)。本發(fā)明的EGFRvIII特異性結(jié)合蛋白的結(jié)合可能抑制內(nèi)化，而不是誘導(dǎo)內(nèi)化，或者可 能促進EGFRvII I表達的增加，從而導(dǎo)致其細胞表面密度增加。
[000引可使用親和力成熟技術(shù)(affinity maUiration technique)使運些高親和力結(jié)合 蛋白的親和力得到進一步大幅提高W獲得對EGFRWII有特異性、Kd在l(K)pM范圍或更低的 結(jié)合蛋白。令人驚訝的事實是，運些結(jié)合蛋白展示了結(jié)合EGFRvIII的異常特異性，且對天然 EGFR(野生型EGFR或EGFRwt)沒有交叉反應(yīng)性。由于來自EGFR細胞外結(jié)構(gòu)域(外顯子2-7)的 269個氨基酸的框內(nèi)（in-打ame)缺失，因此相對于EGFRwt，在EGFRWII中形成新表位(neo- epitope)，且預(yù)計該新表位相當?。浩溆尚碌陌被岵⒘?novel化xtaposition of amino acidsK氨基酸5融合于氨基酸274)和缺失位點處的一個新的GLY氨基酸組成。
[0006] 親和力成熟篩選方法的目的在于通過促進解離速率化OFF)降低的結(jié)合蛋白的選擇 來提高結(jié)合親和力。然而，令人驚訝的是，所顯示的親和力成熟的結(jié)合蛋白大大增加了結(jié)合 速率化ON)，而koFF的降低對結(jié)合蛋白的提高達100倍的結(jié)合僅有小的貢獻，其中一些可變抗 體結(jié)構(gòu)域顯示Kd小于lOOpM。
[0007] 運些獨特的性質(zhì)使運些本文所描述的對EGFRvIII有特異性的可變抗體結(jié)構(gòu)域特 別適用于開發(fā)多特異性的，例如雙特異性的、多價的、免疫效應(yīng)細胞參與（immune effector cell engaging)、腫瘤祀向抗體治療，諸如，例如EGFRvII I/CD3雙特異性串聯(lián)雙抗體 (TandAb").
[0008] 在本發(fā)明的進一步方面中，提供了多價EGFRWII結(jié)合抗體，其對EGFRWII具有兩 個結(jié)合位點，或在多價雙特異性抗體的情況下，除對EGFRvHI具有兩個結(jié)合位點之外，還對 T-細胞抗原CD3或特異性表達于天然殺傷(NK)細胞上的CD16A具有結(jié)合位點。
[0009] 在一個實施例中，使用對EGFRWII具有兩個結(jié)合位點并另外包含對CD3具有兩個 結(jié)合位點的EGFRvII I/CD3串聯(lián)雙抗體，并測試了它們與重組EGFRvII I-或EGFR-Fc融合抗原 的結(jié)合。在非還原條件下（由于完整的二硫鍵，分子結(jié)構(gòu)仍部分保留），或在還原條件下（蛋 白結(jié)構(gòu)完全變性），EGFRvIII-或EGFR-Fc融合抗原通過SDS-PAGE分離，通過蛋白質(zhì)印跡 (Western Blotting)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并使用不同的EGFRVIII/CD3串聯(lián)雙抗體抗體(diabody ant化ody)或EGFR-結(jié)合IgG西妥昔單抗來評估結(jié)合W修飾(decorate)印跡（圖4)。該實施例 顯示，包含對EGFRvIII具有兩個結(jié)合位點的親代EGFRvIII結(jié)合結(jié)構(gòu)域和親和力成熟的 EGFRvH I結(jié)合結(jié)構(gòu)域在多價抗體形式中也保持其對EGFRvH I的選擇特異性。在還原和非還 原條件下，所有EGFRWII/CD3串聯(lián)雙抗體均能識別EGFRvIII，但在任意的運些條件下均不 能識別全長野生型EGFR。該實施例還證明，本文所描述的EGFRWII特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域能識 別線性表位，且其反應(yīng)性不需要完整的Ξ維結(jié)構(gòu)。運與EGFR-結(jié)合IgG抗體西妥昔單抗(愛必 妥化rbitux))相反，EGFR-結(jié)合IgG抗體西妥昔單抗能識別野生型EGFR和成熟的EGFRvIII， 但其反應(yīng)性顯然需要完整二硫鍵與構(gòu)象表位(圖4)。
[0010] 在另一個實施例中，使用包含與不同CD3結(jié)合結(jié)構(gòu)域組合的親代的或親和力成熟 的EGFRvIII特異性結(jié)構(gòu)域和/或在串聯(lián)雙抗體分子中具有不同順序單個結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 EGFRvII I/CD3串聯(lián)雙抗體。具有結(jié)構(gòu)域順序Vl?3-VhEwkviiI-VlEwkviiI-Vh?3的串聯(lián)雙抗體在串 聯(lián)雙抗體分子的中部含有二價EGFRvIII結(jié)合位點，而具有結(jié)構(gòu)域順序VhEwkviiI-化?3-Vh?3- 化EGWviii的串聯(lián)雙抗體在外面的位置具有兩個EGFRvIII結(jié)合位點且在中部具有兩個CD3結(jié) 合位點。在ELISA中，分析串聯(lián)雙抗體的不同EGFRvIII-結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域順序突變體與 EGFRvIII抗原、野生型EGFR抗原的濃度依賴性結(jié)合W及與CD3抗原的濃度依賴性結(jié)合（圖 6)。所有含有親和力成熟的EGFRvIII結(jié)合結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)雙抗體均顯示了與EGFRvIII結(jié)合的 大幅提高，清楚地表現(xiàn)為相應(yīng)的結(jié)合曲線向較低濃度移位大于兩個數(shù)量級（圖6)。沒有觀察 到任何串聯(lián)雙抗體與野生型EGFR抗原的結(jié)合。
[0011 ] 可通過隧菌體展示文庫（phase display libraries)選擇和鑒定抗EGFRWiUjt 體，例如選擇性地結(jié)合成熟的而非天然形式(native form)的EGFR的抗原-結(jié)合蛋白。Τ細胞 是不能由天然抗體募集的有效的腫瘤殺傷效應(yīng)細胞。因此，在本發(fā)明的進一步方面中，本發(fā) 明提供了一組多特異性EGFRVIII/CD3抗原-結(jié)合蛋白，特別是串聯(lián)雙抗體，其能募集Τ細胞、 具有寬范圍的結(jié)合特性和細胞毒性特性。在一組體外試驗中表征了本發(fā)明的抗原-結(jié)合蛋 白的結(jié)合特性、Τ細胞介導(dǎo)的細胞毒性活性和祀標介導(dǎo)的Τ細胞活化的特征。在FACS中，本發(fā) 明的抗原-結(jié)合蛋白對Biacore、ELISA和EGFRvIII-陽性細胞中的EGFRvIII抗原顯示異常的 特異性。在測試的全濃度范圍內(nèi)，沒有觀察到任何結(jié)合蛋白與EGFR抗原或與EGFRwt表達細 胞的可檢測的結(jié)合。最有效的高親和力串聯(lián)雙抗體對表達EGFRvII I的F98神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞 和C冊細胞顯示EC50為IpM-lOpM的細胞毒性;剩余的串聯(lián)雙抗體顯示EC50高達約lOOOOpM的 細胞毒性。也試驗了運些串聯(lián)雙抗體對作為結(jié)合至天然形式的殘基的更敏感探針的EGFRwt +細胞的細胞毒性。直至最大評估的串聯(lián)雙抗體濃度為0 .化Μ時，才在EGFRwt+細胞或其他 EGFRvIII-陰性細胞上觀察到細胞毒性。與CD3的高親和力結(jié)合對有效的T細胞募集是至關(guān) 重要的，然而，在體外不存在EGFRvIIr祀細胞時，如由增殖缺乏測量，本發(fā)明的串聯(lián)雙抗體 沒有引起τ細胞活化，運有助于良好的臨床前安全性（圖10)。總之，抗腫瘤細胞毒性的嚴格 特異性和高效性由EGFRvII I/CD3串聯(lián)雙抗體介導(dǎo)。
[001引產(chǎn)生了具有CD3結(jié)合Kd范圍為1. InM至約500nM但相對恒定的EGFRvin結(jié)合Kd(范圍 為2. OnM-6.7nM)的串聯(lián)雙抗體，其顯示了對表達EGFRvH I的細胞的CD3結(jié)合強度和細胞毒 性效力的良好相關(guān)性，其ECso值范圍為25pM至約lOOOOpM(圖11)。
[0013] 雖然本發(fā)明的抗原-結(jié)合蛋白對EGFRWII的親和力已得到顯著提高，但特異性沒 有損失。
[0014] TandAb'^是用于表示串聯(lián)雙抗體的Affimed Therapeutics的商標化ipriyanov et al.,1999,J.Mol.Biol,293:41-56；Cochlovius et al.,2000,Cancer Res.,60:4336- 4341;Reusch et al.,2004,Int.J.化ncer,112:509-518,Kipriyanov,2009,Methods Mol Biol,562:177_93;McAleese and Eser,2012,Future Oncol.8:687-95)。在本發(fā)明的上下 文中，TandAb和串聯(lián)雙抗體作為同義詞使用。
[0015] 野生型EGFR基因和蛋白的序列是已知的。EGFRvIII是野生型EGFR基因的外顯子2- 7(8(Ubp)的框內(nèi)缺失的結(jié)果，導(dǎo)致受體外部結(jié)構(gòu)域的267個氨基酸缺失，并在外顯子1和8的 接點處產(chǎn)生新的甘氨酸殘基。EGFR胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)的該新的氨基酸并列產(chǎn)生腫瘤特異性和免 疫原性表位。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，描述了對至少EGFRWII具有特異性的結(jié)合蛋白，其不 與野生型EGFR交叉反應(yīng)。該結(jié)合蛋白優(yōu)選包括選自下表1A中所描述的CDR的抗體可變重鏈 的CDR1、CDR2、CDR3和抗體可變輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3。
[0017] 表1A:來自特異性結(jié)合EGFRWII的結(jié)合蛋白的人類輕鏈和重鏈CDR的氨基酸序列 的序列標識號 [001 引
[0019]
[0020] 因此，本發(fā)明的實施方案是具有至少一個EGFRWII結(jié)合位點的EGFRvIII結(jié)合蛋 白，包含抗體可變重鏈結(jié)構(gòu)域和/或抗體可變輕鏈結(jié)構(gòu)域;其中，所述抗體可變重鏈結(jié)構(gòu)域 包含選自沈Q ID 側(cè)：27、33、42、46、49、53的〔〇1?1，選自沈01〇側(cè)：28、38、43、50、54、61、63 的〔032和沈9 10顯:29的〔01?;所述抗體可變輕鏈結(jié)構(gòu)域包含選自569 10^:30、34、36、 39、44、47、51、56、59、64的〔01?1，選自沈9 10側(cè)：31、40、57的〔01?2和選自沈9 10側(cè)：32、35、 37、41、45、48、52、55、58、60、62和65的〔0尺3。
[0021] 根據(jù)進一步的實施方案，所述結(jié)合蛋白包含具有選自如表1B所示的SEQ ID N0:1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21和25的抗體可變重鏈結(jié)構(gòu)域和/或選自如表18所示的569 10 N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和26的抗體可變輕鏈結(jié)構(gòu)域的至少一個EGFRvIII結(jié)合 位點。Ξ個可變輕鏈CDR和Ξ個可變重鏈CDR的氨基酸序列在表1中W粗體顯示且加有下劃 線。運些結(jié)構(gòu)位點顯示對EGFRvIII的親和力提高，而特異性沒有損失。運些抗原-結(jié)合蛋白 不與野生型EGFR抗原交叉反應(yīng)。
[0022] 進一步地，本發(fā)明的運些抗原-結(jié)合蛋白在結(jié)合EGFRWII時沒有顯示或僅顯示最 小化的EGFRvIII內(nèi)化。根據(jù)本發(fā)明，在根據(jù)實施例9的測試條件下，在細胞暴露于EGFRvIII- 結(jié)合抗體之后，大于80%，優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于95%的EGFRvin受體分子仍保留在細 胞表面。本發(fā)明的EGFRvin特異性結(jié)合蛋白的結(jié)合可能抑制內(nèi)化，而不是誘導(dǎo)內(nèi)化，或者可 能促進EGFRvII I的表達增加，從而導(dǎo)致其細胞表面密度增加。
[0023] 術(shù)語"結(jié)合蛋白"是指具有抗原結(jié)合性質(zhì)的免疫球蛋白衍生物，即含有抗原結(jié)合位 點的免疫球蛋白多膚或其片段。該結(jié)合蛋白包含抗體的可變結(jié)構(gòu)域或其片段。每個抗原-結(jié) 合結(jié)構(gòu)域都由結(jié)合相同表位的抗體即免疫球蛋白、可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)和抗體可變輕鏈結(jié) 構(gòu)域(VL)形成。本發(fā)明的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域或可變重鏈結(jié)構(gòu)域是包含CDRUCDR2和CDR3的多 膚。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合蛋白缺乏免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域。術(shù)語"結(jié)合蛋白"也指抗體片段 或衍生物，包括化b Jab '、F(ab '）2、Fv片段、單鏈Fv、雙抗體、串聯(lián)雙抗體(TandAbK ；)、彈性 抗體 ^1姑16〇(17，胖003/025018)、串聯(lián)單鏈尸￥((3。尸￥)2)。
[0024] 表1B:所有抗-EGFRvin可變重鏈結(jié)構(gòu)域(VH)和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(VL)的氨基酸序 列（CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列W粗體顯示且加有下劃線）
[0025]
[0026]
[0027]
[0028] 在優(yōu)選的實施方案中，賦予對EGFRWII具有特異性的結(jié)合蛋白包含來自表1所示 的可變重鏈結(jié)構(gòu)域和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域的W下組合之一的抗原結(jié)合位點：
[0029] (i)沈Q ID N0:1 和沈Q ID N0:2，
[0030] 。1)沈9 10^):3和沈9 10^):4，
[0031 ] (iii)沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6，
[0032] (iv)沈Q ID N0:7和沈Q ID N0:8，
[0033] (V)沈Q ID N0:9和沈Q ID N0:10，
[0034] (vi)沈Q ID NO: 11和沈Q ID NO: 12，
[0035] (乂^)569 10^):13和沈9 10^):14，
[0036] (乂^1)沈9 10^):15和沈9 10^):16，
[0037] (ix)沈Q ID NO:17和沈Q ID NO: 18，
[003引（x)WQIDN0:l^PWQIDN0:20，
[0039] (xi)沈Q ID N0:21 和沈Q ID N0:22,或
[0040] (又11)56910^):25和沈910^):26。
[0041] 本發(fā)明還提供不僅對EGFRvIII具有特異性，而且還具有至少一個其他功能結(jié)構(gòu)域 的結(jié)合蛋白。在進一步的實施方案中，所述至少一個其他功能結(jié)構(gòu)域是效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域 (effector domain)。"效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域"是對效應(yīng)細胞有特異性的結(jié)合位點，其可刺激或觸發(fā) 細胞毒性、吞隧、抗原呈遞、細胞因子釋放。運樣的效應(yīng)細胞是，例如但不限于，T-細胞或NK- 細胞。特別是，所述其他效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域包含形成CD3優(yōu)選人類CD3的抗原結(jié)合位點的至少一 個抗體可變重鏈結(jié)構(gòu)域和至少一個可變輕鏈結(jié)構(gòu)域。
[0042] 因此，本發(fā)明的EGFRvIII結(jié)合蛋白可W是多特異性的。本文所用的術(shù)語"多特異性 的"意思是指本發(fā)明的結(jié)合蛋白對不同的表位具有至少兩個抗原結(jié)合位點，其中至少一個 用于EGFRvIII。例如，結(jié)合蛋白可W是Ξ特異性的，并且對腫瘤細胞上的兩個不同的表位 和/或抗原具有結(jié)合位點且對效應(yīng)細胞諸如例如CD3上的表位或抗原具有至少一個結(jié)合位 點。結(jié)合蛋白對相同抗原的不同表位和/或不同抗原的表位可具有結(jié)合位點。運樣的多特異 性結(jié)合蛋白包括單鏈雙抗體、（scFv)2、串聯(lián)雙抗體pTandAb?；)和彈性抗體（參見Le Gall et al.，1999F邸S Letts 453:164-168和WO 03/025018)。在本發(fā)明的具體實施方案中，結(jié) 合蛋白是對EGFRv III和CD3雙特異性的。
[0043] 本發(fā)明的多特異性結(jié)合蛋白的CD3結(jié)合位點可由如下組成:如表2所示的可變重鏈 結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:23)和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:24)，或與CDR序列僅兩個氨基酸不同 的該序列的密切同源物山1〇36 homolog)，或?qū)D3(稱為CD3)有特異性的任何其他全人的、 人源化的或非人可變抗體結(jié)構(gòu)域，諸如，例如，對CD3，特別是CD3e有特異性的可變抗體結(jié)構(gòu) 域或任何其他全人的、人源化的或非人可變抗體結(jié)構(gòu)域，諸如，例如UCHT1或0KT3的可變抗 體結(jié)構(gòu)域。
[0044] 表2:全人抗-CD3可變重鏈結(jié)構(gòu)域（VH)和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域（VL)的氨基酸序列 (CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列W粗體顯示且加有下劃線）
[0045]
[0046] 此外，本發(fā)明的EGFRWII結(jié)合蛋白可W是多價的。本文所用的術(shù)語"多價的"意思 是指，本發(fā)明的結(jié)合蛋白包含至少兩個抗原結(jié)合位點。抗原結(jié)合位點可具有相同或不同的 特異性。在本發(fā)明的實施方案中，結(jié)合蛋白W至少兩個結(jié)合位點即二價方式結(jié)合相同表位。 二價的結(jié)合蛋白的實例是雙抗體，至少四價的結(jié)合蛋白的實例是串聯(lián)雙抗體。
[0047] 在本發(fā)明進一步的方面中，所述的EGFRWII結(jié)合蛋白W及雙特異性EGFRWIKP CD3結(jié)合位點是人源化的或全人的，即人源的。在本發(fā)明進一步的方面中，EGFRvIII結(jié)合蛋 白或多特異性EGFRvIII和CD3結(jié)合蛋白是二聚體，即包含兩個具有EGFRvIII和CD3抗原結(jié)合 位點的多膚。
[004引根據(jù)本發(fā)明，W串聯(lián)雙抗體(TandAb'K)的形式提供二聚雙特異性EGFRWII和CD3 結(jié)合蛋白。運樣的串聯(lián)雙抗體通過連接能夠同源二聚的四個抗體可變結(jié)合結(jié)構(gòu)域(單基因 構(gòu)建體中的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)(參見McAleese and Eser ,2012， 化ture化col. 8:687-95))來構(gòu)建。在運樣的串聯(lián)雙抗體中，接頭（1 inker)長度是其防止可 變結(jié)構(gòu)域的分子間配對W致分子不能折疊回其本身上來形成單鏈雙抗體，而是被迫與另一 條鏈的互補結(jié)構(gòu)域(complementary domain)配對。對運些結(jié)構(gòu)域還可W運樣排列，即使得 相應(yīng)的VH和化結(jié)構(gòu)域在二聚期間配對。由單個基因構(gòu)建表達后，兩條同樣的多膚鏈頭尾折 疊形成約llOkDa的功能性非共價同源二聚體(McAleese and Eser,2012,Ρ\ι1:ι?Γθ Oncol.8: 687-95)。盡管不存在分子內(nèi)共價鍵，同源二聚體一旦形成即是高度穩(wěn)定的，保持完整并且 不恢復(fù)為單體形式。
[0049] 在多特異性串聯(lián)雙抗體的一個實施方案中，提供了人源化的雙特異性四價抗體 (TandAb?)，其對CD巧蛇GFRvII I各具有兩個結(jié)合位點巧GFRvII I/CD3 REC民Urr-TandAb、3 )，W利用T細胞的細胞毒性能力治療成膠質(zhì)細胞瘤(GB)、前列腺癌、頭頸癌W及其他表皮生 長因子受體突變體VIII陽性化GFRVIII+)癌。
[0050