一種降低單克隆抗體生產(chǎn)中宿主細(xì)胞蛋白含量的親和純化工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種降低單克隆抗體生產(chǎn)中宿主細(xì)胞蛋白 (HCP)含量的親和純化工藝方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗體藥物生產(chǎn)過程中親和純化是非常關(guān)鍵的一個工藝步驟，該過程對發(fā)酵液中的 抗體進(jìn)行捕獲濃縮，實現(xiàn)抗體粗純化的第一步。在中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CH0)等基因工程細(xì) 胞株大批量發(fā)酵過程中，細(xì)胞在不同的生理周期會有凋亡裂解，釋放宿主細(xì)胞蛋白（Host cell protein，HCP)。HCP是指來源于宿主細(xì)胞的蛋白成分，包括宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白和轉(zhuǎn)化 蛋白（細(xì)胞分泌的促生長蛋白）。HCP不僅有可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗HCP抗體，引起過敏反應(yīng)， 還有可能有"佐劑效應(yīng)"引起機(jī)體對蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)生抗體，影響藥物治療效果，定量測定基 因工程藥物中殘留的HCP是質(zhì)量控制的一種重要手段，有助于保持純化工藝的有效性和一 致性。在抗體親和純化中，保證高效率的抗體回收率的同時，要對發(fā)酵過程中工程細(xì)胞所 產(chǎn)生的HCP進(jìn)行有效去除。因此，研究出一種能廣泛應(yīng)用于抗體大規(guī)模發(fā)酵后較為經(jīng)濟(jì)可 行的抗體親和純化工藝，對于抗體藥物的進(jìn)一步產(chǎn)業(yè)化推廣是極其有意義的，本發(fā)明涉及 即是此方面內(nèi)容。目前能夠進(jìn)行HCP殘留去除的方法較多，各有特點：1)層析方式：包括 Protein A親和層析，陰、陽離子層析，三種層析工藝中對HCP的去除能力，Protein A親和 層析為基礎(chǔ)，去除能力較強(qiáng)，是HCP去除的主要步驟，陰、陽離子層析則主要作為后續(xù)HCP的 進(jìn)一步再去除工藝。層析方式去除HCP的工藝在不斷完善過程中，各種層析工藝在不斷的 提出應(yīng)用實際生產(chǎn)，是HCP去除的主要手段；2)切向流超濾方式：對于HCP的去除能力有 限，且不易控制殘留量，工藝控制系數(shù)不高，只能作為去除HCP的輔助工藝；3)聚合物沉淀 方式：PEG、聚丙烯酸等高聚合物在較廣的PH范圍內(nèi)帶正電荷，通過電荷作用同抗體結(jié)合形 成沉淀，而HCP由于等電點較低，不易發(fā)生沉淀。沉淀抗體樣品的HCP含量明顯降低，但該 工藝不適于工藝放大，且沉淀對抗體的活性可能有一定影響。因此，去除HCP的工藝方法眾 多，由于各項目的抗體的樣品發(fā)酵工藝及抗體性質(zhì)的不同，需進(jìn)行綜合考慮選擇工藝。
[0003] 本發(fā)明所述工藝的原理，是利用在親和層析的預(yù)洗脫中降低HCP同抗體及填料基 質(zhì)間的作用，即通過聚山梨酯80 (Tween 80)、聚山梨酯20 (Tween 20)、尿素等活性試劑能 夠不同程度地減弱HCP同抗體蛋白及填料介質(zhì)間的作用力，而起到去除HCP的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了解決抗體生產(chǎn)中宿主細(xì)胞蛋白（HCP)殘留的問題，而公開了一種抗體 純化生產(chǎn)中有效降低CH0宿主細(xì)胞蛋白（HCP)的新方法，可以廣泛適用于抗體親和純化工 藝中，且所使用的材料成本價格較低，易于工藝放大。在本發(fā)明中，主要通過抗體親和層析 中間預(yù)洗脫來有效降低HCP含量，滿足抗體藥物的大規(guī)模高質(zhì)量純化制備要求，保證抗體 藥物的臨床使用的安全。
[0005] 為了達(dá)到本發(fā)明中的目的主要采取以下措施： 1. 收集發(fā)酵上清液。
[0006] 2.親和層析。發(fā)酵液進(jìn)行親和層析，親和介質(zhì)包括但不限于Protein A、Protein G、Protein L等可同抗體特異性結(jié)合的配基交聯(lián)到瓊脂糖、羥基化聚醚樹脂、聚丙烯酸樹 月旨、聚苯乙烯二乙烯苯基樹脂、聚甲基丙烯酸樹脂、聚苯乙烯樹脂、羥基磷灰石、玻璃等基 質(zhì)上的層析介質(zhì)，優(yōu)選基質(zhì)為瓊脂糖。優(yōu)選的親和填料有GE healthcare的Mabselect、 Mabselect Sure,博格隆生物技術(shù)有限公司的Protein A diamond等。優(yōu)選的親和介質(zhì)配 基為Protein A或在Protein A基礎(chǔ)上做結(jié)構(gòu)優(yōu)化的配基。層析步驟如下： 2. 1上樣：上樣緩沖液包括但不限于磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液、硼酸-硼砂緩沖 液等，優(yōu)選為磷酸鹽緩沖液或Tris-鹽酸緩沖液，更優(yōu)選的可在緩沖液中加入NaCl或Na 2S04 來降低非抗體蛋白同Protein A填料間的非特異性吸附，所述磷酸鹽緩沖液的鹽濃度為 5mM-0. 15M之間，優(yōu)選的為10mM-50mM之間，更優(yōu)選的是20mM ;pH為5. 5-8. 0之間；優(yōu)選的為 6. 5-7. 5之間，更優(yōu)選的是7. 0，NaCl或Na2S04的濃度優(yōu)選為0-250mM，更優(yōu)選的可為150mM 2. 2中間洗脫：中間洗脫緩沖液包括但不限于以下緩沖液中的一種或幾種的組合：1) 中性緩沖液體系，例如：磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸等；2)酸性的緩沖液體系：檸檬 酸-磷酸氫二鈉、醋酸-醋酸鈉、檸檬酸-檸檬酸三鈉等。中間洗脫緩沖液中可添加活性試 劑，包括但不限于聚山梨酯80 (Tween 80)、聚山梨酯20 (Tween 20)、尿素、異丙醇、丙二 醇、乙二醇、四甲基氯化銨等，優(yōu)先的為Tween 80，Tween 80的濃度在0· 05%-5%之間，優(yōu)選 的是0. 1%-1%之間，更優(yōu)選的是0. 5%。所述中間預(yù)洗脫緩沖液的鹽濃度范圍在0M-0. 5M之 間，優(yōu)選為〇. 15M。中間洗脫緩沖液的pH為5. 0-7. 5之間，優(yōu)選的是7. 0。
[0007] 2. 3終洗脫：洗脫緩沖液包括但不限于以下緩沖液中的一種或幾種的組合：檸檬 酸、Gly-鹽酸及醋酸緩沖液等，PH范圍從2. 0-7. 0,優(yōu)選的PH為3. 0-4. 0。洗脫緩沖液的 濃度范圍為5-100 mM，優(yōu)選的為20-50mM。洗脫后可將親和介質(zhì)再生，再生緩沖液包括但不 限于檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、鹽酸、甘氨酸、NaOH，優(yōu)先為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液及 NaOH溶液。
[0008] 在其中一個實施例中，所用的抗體為人源化兔抗人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF) IgGl 型單克隆抗體，這是一種可用于治療年齡相關(guān)性黃斑病變（AMD)的藥物。在另一個實施例 中，所用的抗體是一種完全人源性抗TNF-a IgGl型單克隆抗體，適用于治療中度和嚴(yán)重風(fēng) 濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎和克羅恩病。在另一個實施例中，所用的抗體抗 RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，即核因子 κΒ 配體受 體激活劑）的人源IgG2型單克隆抗體，用于預(yù)防絕經(jīng)期婦女骨質(zhì)疏松相關(guān)性骨折。所選用 的抗體類型只為說明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，本發(fā)明所述的方法可適用于 其他類型的抗體。
[0009] 本發(fā)明中的抗體Protein A親和純化工藝簡單易行，能夠進(jìn)行放大純化生產(chǎn)，細(xì)胞 發(fā)酵上清液無需進(jìn)行前預(yù)處理，洗脫樣品得率較高，同時HCP殘留量也保持在較低水平(殘 留控制量不高于〇. 05%)，從而減輕之后純化步驟中去除HCP的壓力，從而保證抗體最終樣 品的HCP殘留量處于極低水平。同時，發(fā)明中經(jīng)過對不同抗體發(fā)酵上清液進(jìn)行親和純化工 藝驗證，證明本發(fā)明中的親和純化工藝具有較強(qiáng)的適用性及良好的穩(wěn)定性。
[0010]
【具體實施方式】 以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所 揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施 方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本 發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0011] 哺乳動物細(xì)胞 本發(fā)明所述單克隆抗體體外發(fā)酵生產(chǎn)使用的哺乳動物細(xì)胞包括但不限于目前通用的 各種雜交瘤細(xì)胞、中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CH0)，優(yōu)選的是CH0細(xì)胞。
[0012] 抗體 本發(fā)明所述抗體是通過將鼠、兔單克隆抗體進(jìn)行人源化改造或通過噬菌體展示等技術(shù) 獲得的完全人源化單克隆抗體后，并在體外哺乳動物細(xì)胞中發(fā)酵表達(dá)而得到的。體外表達(dá) 的單克隆抗體包括IgG、IgGA、IgE、IgD、IgM等類型。
[0013] 實施例1 VEGF單克隆抗體發(fā)酵液的HCP清除 人源化兔抗人血管內(nèi)皮生長因子（VEGF)的發(fā)酵，CH0細(xì)胞作為宿主細(xì)胞，EXCELL302作 為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)工藝進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，（在基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入4mmol/L的谷 氨酰胺、400nmol/L的MTX，WAVE生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，起始培養(yǎng)參數(shù)溫度37 °C，WAVE 擺動角度8°，擺動速率12rpm，通入氣體Air/C02/ 02, pH控制在7· 0, Do控制在60%± 10%， 接種密度0.3-0. 5X106個/ml，在培養(yǎng)過程中按1:1流加 CD Efficient Feed? A AGT跟CD Efficient Feed? B AGT，一共各加入原始培養(yǎng)體積的20%，培養(yǎng)過程中若葡萄糖濃度低于 1. 5g/L，則通過添加葡萄糖濃縮液將培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度提高至3g/L)，當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)活細(xì) 胞密度<3. 0X106個/ml時，終止培養(yǎng)過程，6000~7000 g，30分鐘離心，收集上清，記為 發(fā)酵液中間體，重復(fù)發(fā)酵3批。每批發(fā)酵后取發(fā)酵液25. 0L，上樣于Protein A層析柱（GE Mabselect，500ml)，上樣載量為 30.0 mg/ml。上樣平衡緩沖液