出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gat1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl，還涉及出 芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl在提高聚蘋果酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚蘋果酸(Polymalic acid，PMA)是一種新型的可完全生物降解的聚酯型聚合物， 由于其具有良好的水溶性，生物降解性和生物相容性，可用于生物醫(yī)學(xué)材料、營養(yǎng)強(qiáng)化劑、 食品包裝等領(lǐng)域，具有廣泛的應(yīng)用前景。此外，聚蘋果酸的單體為L-蘋果酸，是一種優(yōu)良的 食品酸化劑，市場年需求在10萬噸以上。
[0003] 聚蘋果酸主要由出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)代謝產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)發(fā) 酵過程氮源對聚蘋果酸合成及細(xì)胞生長具有顯著影響，且在氮限制條件下有利于聚蘋果酸 合成，但是對于該機(jī)制并不十分清楚，如氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl是否參與調(diào)控聚蘋果酸合成 尚未報道。因此，有必要對氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl進(jìn)行研究，探究氮源對聚蘋果酸合成影響的 原因，以進(jìn)一步提高聚蘋果酸的產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl;本發(fā)明 的目的之二在于提供含有編碼出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl基因的過表達(dá)載體;本發(fā)明 的目的之三在于提供出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl在提高出芽短梗霉聚蘋果酸產(chǎn)量中 的應(yīng)用;本發(fā)明的目的之四在于提供含有編碼所述出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl基因的 過表達(dá)載體在提高出芽短梗霉聚蘋果酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0005] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 1、出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl，其氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示;編碼區(qū)的 核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示;基因組序列如SEQ ID N0.3所示。
[0007] 2、含有編碼所述出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl基因的過表達(dá)載體。
[0008] 優(yōu)選的，所述過表達(dá)載體由以下方法構(gòu)建:擴(kuò)增編碼出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子 Gat 1的基因組序列，然后連入過表達(dá)載體pBARGPEI的構(gòu)巢曲霉gpdA強(qiáng)啟動子與trpC終止子 之間，然后擴(kuò)增含構(gòu)巢曲霉gpdA強(qiáng)啟動子、出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl和trpC終止子 的表達(dá)框，連入pk2-bar-gus的EcoRI酶切位點處，得過表達(dá)載體。
[0009] 優(yōu)選的，擴(kuò)增編碼出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl的基因組序列的引物如SEQ ID NO. 26和SEQ ID NO. 27所示；擴(kuò)增含構(gòu)巢曲霉gpdA強(qiáng)啟動子、出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子 Gatl和trpC終止子的表達(dá)框的引物如SEQ ID N0.28和SEQ ID N0.29所示。
[0010] 3、所述出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl在提高出芽短梗霉聚蘋果酸產(chǎn)量中的應(yīng) 用。
[0011] 4、所述含有編碼所述出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl基因的過表達(dá)載體在提高 出芽短梗霉聚蘋果酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明成功獲得了出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl基 因，并獲得了該基因的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示，編碼區(qū)序列如SEQ ID N0.4所示，基 因組序列如SEQ ID N0.3所示;對基因功能研究發(fā)現(xiàn)，敲除出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl 基因后出芽短梗霉的生物量降低，同時聚蘋果酸產(chǎn)量也降低;而過表達(dá)出芽短梗霉氮響應(yīng) 轉(zhuǎn)錄因子Gatl后聚蘋果酸產(chǎn)量明顯提高，約為10-30%，對進(jìn)一步提高聚蘋果酸產(chǎn)量具有重 要意義，同時對提高出芽短梗霉其他代謝產(chǎn)物如普魯蘭多糖等的發(fā)酵產(chǎn)量也具有指導(dǎo)意 義。
【附圖說明】
[0013] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0014] 圖 1 為pk2_gus 和pk2-Ptrpc_hyg-Ttrpc 載體圖譜（A:pk2_gus ;B:pk2-Ptrpc_hyg-Ttrpc)〇
[0015] 圖2為出芽短梗霉敲除轉(zhuǎn)化子的PCR引物設(shè)計原理圖及驗證結(jié)果。
[0016] 圖3為pBARGPEI和pk2-bar-gus的載體結(jié)構(gòu)圖（A:pBARGroi載體結(jié)構(gòu)圖；B:pk2-bar-gus載體結(jié)構(gòu)圖）。
[0017] 圖4為出芽短梗霉Gatl過表達(dá)菌株的PCR驗證。
【具體實施方式】
[0018] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著） 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0019] 實施例1、克隆出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl基因
[0020] 根據(jù)出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)全基因組測序結(jié)果，利用生物信息 學(xué)軟件設(shè)計氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl基因組擴(kuò)增引物，上游引物為Gat 1-F: 5'-atgacatcgccgcgcacc-3'（SEQ ID Ν0· 1);下游弓丨物：5'-ttacaaactcatggtaagccattccc-3' (SEQIDN0.2)，然后以出芽短梗霉(A.pullulansCCTCCM2012223)基因組DNA為模板，進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s，30 個循環(huán)；72°C后延伸10min;25°C保溫10min。然后將PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，并回收目的片 段，回收產(chǎn)物連接pMD 19-T Vector，經(jīng)測序獲得如SEQ ID N0.3所示序列，其開放閱讀框序 列如SEQ ID N0.4所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0021] 實施例2、出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl基因敲出
[0022] (1)出芽短梗霉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl基因敲除載體的構(gòu)建
[0023] 利用同源重組的方法，以潮霉素抗性標(biāo)記hyg替換掉氮響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Gatl中 1074bp的一段序列，包括從ATG開始的894bp和ATG上游的180bp，以破壞其表達(dá)。具體是以出 芽短梗霉(A.pullulans CCTCC M2012223)基因組為模板，使用phata Max Super-Fidelity D N A polymerse 高保真 Taq 酶，W5arm-F:5'-agtggatcccccggggaattcccatactgtcccatttctcg_3'（SEQ ID N0.6);5arm-R:5'_ cagtaggttagctggggttgc-3 '（SEQ ID NO. 7)擴(kuò)增上游同源臂5arm，同時以3arm_F: 5 ' -gtttagaggtaatccttcttcaaacgacgtgccgactgc-3'（SEQ ID N0.8);3arm-R:5'- acagctatgacatgattacggcaaccattcgtgtaggagcag-3'（SEQ ID N0.9)為引物擴(kuò)增下游同源 臂3arm;獲得的上游同源臂5arm如SEQIDN0.10所示，下游同源臂3arm如SEQIDN0.11所 不。
[0024] 再以pk2-PtrpC-hyg-Ttrpc載體為模板（圖1中B)(參見文獻(xiàn)"涂光偉，王永康，馮 俊，李曉榮，郭美錦，鄒祥.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的出芽短梗霉遺傳轉(zhuǎn)化及高效篩選聚蘋果酸高產(chǎn)菌 株·生物工程學(xué)報，2015,31(7):1063-1072 "）WHYGL-F:5'-caaccccagetaacctactggtcgacagaagatgacattgaag-3'（SEQ ID NO·12)^PHYGL-R:5'-acagctatgacatgattacgtgctccatacaagccaacc-3'（SEQ ID NO. 13)擴(kuò)增潮霉素抗性標(biāo)的左 端 HYG-L (如 SEQ ID N0.14 所示）；同時以！1￥61?-?:5'-agtggatcccccggggaattacctgcctgaaaccgaact_3'（SEQ ID N0.15)和階61?-1?:5'-aagaaggattacctctaaacaagtgt-3'（SEQ ID NO. 16)擴(kuò)增潮霉素抗性標(biāo)的右端HYG-R(如SEQ ID NO. 17所示），其中HYG-L的右端和HYG-R的左端有427bp的同源序列。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊 脂糖凝膠電泳，然后回收備用。
[0025] 使用一步克隆試劑盒（ClonExpress? MultiS One Step Cloning Kit)將上游同 源臂5arm和潮霉素抗性標(biāo)記的左端HYG-L連接至pk2-gus的EcoRI酶切位點處（圖1中A)。具 體原理是:將載體在克隆位點進(jìn)行線性化，并在插入片段PCR引物5'端引入線性化克隆載體 末端序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5 '和3'最末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對應(yīng)的 完全一致的序列（15bp~20bp)，這種兩端帶有載體末端序列的PCR產(chǎn)物和線性化克隆載體 按一定比例混合后，在重組酶的催化下，僅需反應(yīng)30min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。具體 操作是:將pk2_gus載體在EcoRI酶切位點處酶切線性化，在5arm的正向PCR引物5arm_F(SEQ ID NO. 6) 5 '端引入線性化載體pk2-gus上游末端20bp序列，使得5arm的PCR產(chǎn)物5 '端帶有和 線性化載體pk2-gus上游末端對應(yīng)的完全一致的序列（20bp);同理在HYG-L的正向引物 HYGL-F(SEQ ID N0.12)5'端引入5arm片段的下游末端20bp序列，使得HYG-L的PCR產(chǎn)物5'端 帶有和5arm下游末端完全一致的20bp序列；在HYG-L的反向引物HYGL-R(SEQ ID N0.13)5' 端引入線性化載體pk2-gus下游末端20bp序列，使得HYG-L的PCR產(chǎn)物3 '端帶有和線性化載 體pk2-gus下游末端完全一致的20bp序列；然后以線性化載體pk2-gus和插入片段5arm、 HYG-L的PCR產(chǎn)物配制重組反應(yīng)體系，37°C反應(yīng)30min實現(xiàn)將片段5arm和HYG-L順序拼接并克 隆至載體pk2-gus的EcoRI酶切位點處。構(gòu)建敲除載體pk2-gus-5arm-HygL，轉(zhuǎn)化E · co 1 i DH5 α感受態(tài)細(xì)胞;采用同樣的方法，將潮霉素抗性標(biāo)記的右端HYG-R和下游同源臂3arm連接至 pk2-gus的EcoRI酶切位點處，構(gòu)建敲除載體pk2-gus_HygR-3arm(圖1)，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感 受態(tài)細(xì)胞。然后分別以5arm-F/HYGL-R引物和HYGR-F/3arm-R引物PCR驗證轉(zhuǎn)化子，經(jīng)測序驗 證無誤后