梨小果基因及其在調(diào)控植物果實(shí)大小中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種梨小果基因及其在調(diào)控植物果 實(shí)大小中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞大小是決定庫(kù)器官大小的兩個(gè)關(guān)鍵因素，改變其中任何一個(gè)因素 都會(huì)影響植物庫(kù)大小。不過有研究表明細(xì)胞數(shù)目對(duì)控制器官的生物量起著關(guān)鍵的主導(dǎo)作 用。經(jīng)過人工篩選的栽培種果實(shí)或種子都會(huì)比原來(lái)的野生種大很多。通過育種(如通過雜種 優(yōu)勢(shì)育種)作物產(chǎn)量顯著增加，其主要育種目標(biāo)就是通過增加庫(kù)器官中的細(xì)胞數(shù)目來(lái)增大 庫(kù)容。目前，已經(jīng)鑒定出的通過控制細(xì)胞數(shù)目或者細(xì)胞大小來(lái)調(diào)控植物或者器官大小的基 因很少。
[0003] Fruit weight 2.2(fw2.2)是植物中通過負(fù)調(diào)控細(xì)胞數(shù)目來(lái)控制果實(shí)重量或大小 的重要數(shù)量性狀的主效基因。在番茄、大豆和玉米等作物中的fw2.2直系同源基因的上調(diào)表 達(dá)都會(huì)負(fù)調(diào)控庫(kù)器官細(xì)胞數(shù)目，進(jìn)而影響器官大小。然而，本領(lǐng)域?qū)τ谟绊憗喼蘩婀麑?shí)大小 的基因或調(diào)控機(jī)理的了解甚少，因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)調(diào)控亞洲梨果實(shí)大小的相關(guān)基因 及其應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種梨小果多肽及其編碼基因。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)所述多肽的方法以及所述多肽和編碼基因的用途， 尤其是在調(diào)控植物果實(shí)大小方面的用途。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的梨小果多肽(Ppfw2.2)，所述多肽具有調(diào) 控果實(shí)大小的功能，并且，所述多肽選自下組：
[0007] (i)具有SEQ ID Ν0·:2所示氨基酸序列的多肽；
[0008] (ii)將如SEQ ID Ν0. :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺 失或添加而形成的，控制果實(shí)大小功能的，由（i)衍生的多肽;或
[0009] (iii)氨基酸序列與SEQ ID N0. :2所示氨基酸序列的同源性295%(較佳地2 98%，更佳地2 99% )，具有控制果實(shí)大小功能的多肽。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控果實(shí)大小包括調(diào)控果實(shí)的細(xì)胞數(shù)目。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控果實(shí)大小包括調(diào)控果實(shí)的細(xì)胞大小。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控果實(shí)大小包括調(diào)控梨屬植物的果實(shí)大小。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的調(diào)控果實(shí)大小包括調(diào)控亞洲梨的果實(shí)大小。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的梨小果多肽來(lái)自亞洲梨(Pyrus Pyrifolia)。
[0015] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含一核苷酸 序列，所述核苷酸序列編碼本發(fā)明第一方面所述的多肽。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸的序列選自下組的一種：
[0017] (A)編碼如SEQ ID NO. :2所示多肽的多核苷酸；
[0018] (B)序列如SEQ ID NO. :1、或SEQ ID NO. :3所示的多核苷酸；
[0019] (C)核苷酸序列與SEQ ID NO.: 1、或SEQ ID NO. :3所示序列的同源性2 95% (較佳 地2 98 %，更佳地2 99 % )的多核苷酸；
[0020] (D)在SEQ ID N0. :1、或SEQ ID N0. :3所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加 1 -60個(gè)(較佳地1 -30，更佳地1 -10個(gè))核苷酸的多核苷酸；
[0021] (E)與(A)-(D)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的Ppfw2.2編碼基因包括DNA、cDNA和/或mRNA。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸為基因組序列或cDNA序列。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述多核苷酸還包含與所述梨小果多肽的0RF序列操作性連接 的啟動(dòng)子。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的啟動(dòng)子選自下組:組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、誘 導(dǎo)型啟動(dòng)子、或者強(qiáng)啟動(dòng)子。
[0026] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有本發(fā)明第二方面所述的多 核苷酸。
[0027] 在本發(fā)明的第四方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本 發(fā)明第三方面所述的載體或基因組中整合有本發(fā)明第二方面所述的多核苷酸。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞選自下組:植物細(xì)胞、原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括薔薇科植物細(xì)胞。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括梨細(xì)胞。
[0031]在本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述的本發(fā)明第一方面的 方法，所述方法包含：
[0032] (a)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞；
[0033] (b)從培養(yǎng)物中分離出梨小果多肽。
[0034] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種調(diào)控植物果實(shí)大小的方法，所述方法包括以下 步驟:拮抗或促進(jìn)本發(fā)明第一方面所述多肽的表達(dá)或活性。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述植物包括梨屬植物，較佳地為亞洲梨。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括給予植物所述多肽或其編碼基因的拮抗劑從而促 進(jìn)果實(shí)膨大。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括給予植物所述多肽或其編碼基因的促進(jìn)劑從而抑 制果實(shí)膨大。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的詰抗劑包括赤霉素(Gibberellin，GA)。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗劑包括11^、811?嫩、8111^、或其組合。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述方法包括向植物中導(dǎo)入外源的梨小果多肽的編碼基因。
[0041 ]在另一優(yōu)選例中，所述方法包括：
[0042] (i)提供一植物或植物細(xì)胞；
[0043] (ii)將編碼Ppfw2.2多肽的基因序列導(dǎo)入所述植物或植物細(xì)胞，從而獲得轉(zhuǎn)基因 的植物或植物細(xì)胞。
[0044]在另一優(yōu)選例中，所述方法包括步驟：
[0045] (a)提供攜帶Ppfw2.2基因序列的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌；
[0046] (b)將植物細(xì)胞或組織或器官與步驟(a)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使表達(dá)Ppfw2.2多 肽的基因序列轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，并且整合到植物細(xì)胞的染色體上；
[0047] (c)選擇已轉(zhuǎn)入表達(dá)Ppfw2.2多肽的基因序列的植物細(xì)胞或組織或器官；
[0048] (d)將步驟(c)中的植物細(xì)胞或組織或器官再生為植株。
[0049] 在本發(fā)明的第七方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述多肽的抑制劑的用途，用 于制備促進(jìn)植物果實(shí)膨大的組合物。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括農(nóng)用組合物。
[0051 ] 在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑包括miRNA、RNAi。
[0052]在本發(fā)明的第八方面，提供了一種赤霉素的用途，用于制備抑制本發(fā)明第一方面 所述多肽表達(dá)和活性的組合物。
[0053]在本發(fā)明的第九方面，提供了一種改良植物性狀的方法，包括步驟：
[0054] (a)將外源的構(gòu)建物導(dǎo)入植物細(xì)胞，其中所述的構(gòu)建物含有編碼本發(fā)明第一方面 所述多肽的核苷酸序列或抑制本發(fā)明第一方面所述多肽表達(dá)的核苷酸序列，從而獲得導(dǎo)入 外源構(gòu)建物的植物細(xì)胞；
[0055] (b)將上一步驟獲得的所述導(dǎo)入外源構(gòu)建物的植物細(xì)胞，再生成植株：
[0056] (c)任選地對(duì)所述再生的植株進(jìn)行性狀鑒定，從而獲得性狀改良的植物。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述植物包括梨屬植物，較佳地為亞洲梨。
[0058] 在本發(fā)明的第十方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述多肽或其編碼基因的用 途，用于篩選植物果實(shí)膨大促進(jìn)劑或拮抗劑。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述植物包括梨屬植物，較佳地為亞洲梨。
[0060] 在本發(fā)明的第十一方面，提供了一種篩選植物果實(shí)膨大促進(jìn)劑或拮抗劑的方法， 所述方法包括以下步驟：
[0061 ] a)將待測(cè)物質(zhì)給予某植物；
[0062] b)檢測(cè)該植物中Ppfw2.2多肽或其編碼基因的活性或表達(dá)情況；
[0063]如果與未給予待測(cè)物質(zhì)的對(duì)照植物相比，所述Ppfw2.2多肽或其編碼基因的活性 或表達(dá)下調(diào)，則所述待測(cè)物質(zhì)是果實(shí)膨大促進(jìn)劑；
[0064]如果與未給予待測(cè)物質(zhì)的對(duì)照植物相比，所述Ppfw2.2多肽或其編碼基因的活性 或表達(dá)上調(diào)，則所述待測(cè)物質(zhì)是果實(shí)膨大拮抗劑。
[0065] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0066] 圖1顯不了亞洲梨Ppfw2.2基因序列的電泳結(jié)果。其中圖1A顯不了Ppfw2.2基因全 長(zhǎng)序列的電泳結(jié)果，圖1B顯示了 Ppfw2.2基因⑶S序列的電泳結(jié)果。
[0067]圖2顯示了梨Ppfw2.2基因的cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列。
[0068] 圖3顯示了Ppfw2.2三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果。
[0069]圖4顯示了煙草葉片中Ppfw2.2基因表達(dá)產(chǎn)物表達(dá)于質(zhì)膜上。
[0070]圖5顯示了 9個(gè)來(lái)自不同物種的fw2.2氨基酸序列的聚類分析。
[0071] 圖6顯不了不同GA處理的果實(shí)大小。
[0072] 圖7顯示了外源GA處理負(fù)調(diào)控Ppfw2.2在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量。其中圖7A和圖7B分別 顯示了果肉和果心中Ppfw2.2在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量。
【具體實(shí)施方式】
[0073] 發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次從梨中，利用克隆技術(shù)成功篩選到一個(gè)新的 梨小果基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了研究，顯示該基因能調(diào)控植物果實(shí)大小，因此在農(nóng)作物育種 中具有應(yīng)用前景。實(shí)驗(yàn)表明，通過抑制劑抑制Ppfw2.2基因的表達(dá)，可以顯著的促進(jìn)果實(shí)膨 大。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0074] 術(shù)語(yǔ)
[0075]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"梨小果多肽"、"本發(fā)明多肽"、"Ppfw2.2蛋白"、"Ppfw2.2多肽"、 "果實(shí)大小調(diào)控多肽"可以互換使用，都是指來(lái)源于亞洲梨等植物的、具有調(diào)控果實(shí)大小功 能的Ppfw2.2多肽(SEQ ID N0. :2)，或其衍生的具有相同功能的衍生多肽或活性片段。 [0076]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"本發(fā)明基因"、"梨小果多肽編碼基因"、"Ppfw2.2基因"、"果實(shí) 大小調(diào)控基因"可以互換使用，都是指編碼Ppfw2.2多肽的核苷酸序列（包含或不包含其內(nèi) 含子的序列）。一種特別優(yōu)選地Ppfw2.2基因是指來(lái)源于亞洲梨的Ppfw2.2基因。
[0077]如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原 始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化 的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化 的。
[0078] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"特異性表達(dá)"是指