一種monellin蛋白突變體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白突變體技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種monel 1 in蛋白突變體及其制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甜味蛋白111〇11611；[11是西非植物0；[08(30代0口1171111111(3111]1111；[118；[；[中提取的一種天然 甜味劑，具有強烈的甜味，甜度在相同條件下約為相同質(zhì)量蔗糖的3000倍，天然的monellin 蛋白是由兩條不同的肽鏈通過共價鍵結(jié)合在一起，由A鏈和B鏈組合而成，研究發(fā)現(xiàn)天然的 mone 11 in蛋白在高溫下易失去活性，1989年Kim等人通過基因工程方法將兩條肽鏈結(jié)合成 一條蛋白鏈，使其熱穩(wěn)定性得到大大提升，在寬范圍PH下保持穩(wěn)定，同時其甜度未發(fā)生太大 變化。由于本身不含糖分，可以作為糖尿病人和心血管病人的最好甜味替代食品，也可以有 效的預(yù)防兒童離齒的發(fā)生，具有非常大的市場潛力。單鏈monel 1 in蛋白在65°C下處理就會 失去活性，使其在生產(chǎn)和運輸過程中受到了限制。
[0003] 單鏈monellin蛋白采用基因工程手段也在其他生物中表達成功，如大腸桿菌表達 系統(tǒng)、植物表達系統(tǒng)、枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)、但是由于這些表達系統(tǒng)產(chǎn)量和有毒代謝物質(zhì) 的問題使得monel 1 in蛋白無法大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)。采用甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母發(fā)酵使得monel 1 in 蛋白產(chǎn)量得到很大提升，但是由于有毒物質(zhì)甲醇的加入，發(fā)酵產(chǎn)品安全問題成為隱患。
[0004] 另外如何將目的蛋白直接分泌到胞外，節(jié)省后期純化成本，且在發(fā)酵過程中不添 加誘導(dǎo)劑，減少發(fā)酵過程中的染菌概率，另外還要避免有毒代謝物質(zhì)，保證了該蛋白作為食 品添加劑的安全，是本發(fā)明需要解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是針對上述存在的缺陷而提供一種monellin蛋白突變體及其制 備方法。本發(fā)明對單鏈mone 11 in進行了定點突變，得到一種熱穩(wěn)定性突變體，并在畢赤酵母 中成功表達，解決了甜味蛋白在生產(chǎn)運輸中易降解的技術(shù)難題；同時增加了蛋白甜度，使得 在其少量情況下就就能達到良好的甜味效果，為該甜味蛋白大規(guī)模工業(yè)化市場化打下堅實 基礎(chǔ)。采用PGAPZaA質(zhì)粒可以將目的蛋白直接分泌到胞外，節(jié)省了后期純化成本，由于本身 為GADPH自誘導(dǎo)型啟動子，發(fā)酵過程中不需要添加任何誘導(dǎo)劑，減少了發(fā)酵過程中的染菌概 率，同時沒有任何有毒代謝物質(zhì)，保證了該蛋白作為食品添加劑的安全。
[0006] 本發(fā)明的一種monellin蛋白突變體及其制備方法技術(shù)方案為，一種monellin蛋白 突變體，將野生型單鏈monellin基因第2位氨基酸谷氨酸(Glu)定點突變?yōu)樘於０?Asn)。
[0007] 甜度相對于野生單鏈mone 11 in蛋白提升3倍。
[0008] 熱穩(wěn)定性相對于野生單鏈mone 11 in蛋白提升10°C。
[0009 ] 所述的一種mone 11 in蛋白突變體的制備方法，包括以下步驟：
[0010] (1)構(gòu)建野生型單鏈mone 11 in蛋白表達載體；
[0011] (2)將步驟(1)中進行定點突變得到突變基因，挑取陽性轉(zhuǎn)化子測序驗證；
[0012] (3)將步驟（2)中測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，篩選出成功轉(zhuǎn)化的畢赤酵 母；
[0013] (4)在Yro培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達蛋白，時間為3天；
[0014] (5)將步驟⑷中表達的蛋白純化。
[0015] 步驟(1)為，構(gòu)建含有野生型單鏈monellin蛋白基因的表達質(zhì)粒PGAPZaA。
[0016]步驟（2 )突變位點特異性引物：上游？1:[5'_ CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTAACTGGGAG-3 下游 Ρ2:[5'-TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3 ']。
[0017] 步驟(2)中，用Xhol和Notl內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物并與酶切后的PGAPZaA空載體連接， 轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含25μg/ml Zeocin的LLB固體培養(yǎng)基上，過夜培 養(yǎng)挑取陽性單菌落并提取質(zhì)粒，測序驗證突變結(jié)果，構(gòu)建突變質(zhì)粒PGAPZaA_E2N將正確的突 變質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?br>[0018] 步驟(3)中所述的畢赤酵母為畢赤酵母GS115。
[0019] 本發(fā)明的一種monellin蛋白突變體及其制備方法有益效果為：本發(fā)明對單鏈 monellin進行了定點突變，得到一種熱穩(wěn)定性突變體，并在畢赤酵母中成功表達，解決了甜 味蛋白在生產(chǎn)運輸中易降解的技術(shù)難題；同時增加了蛋白甜度，使得在其少量情況下就就 能達到良好的甜味效果，為該甜味蛋白大規(guī)模工業(yè)化市場化打下堅實基礎(chǔ)。采用PGAPZaA質(zhì) ?？梢詫⒛康牡鞍字苯臃置诘桨猓?jié)省了后期純化成本，由于本身為GADPH自誘導(dǎo)型啟動 子，發(fā)酵過程中不需要添加任何誘導(dǎo)劑，減少了發(fā)酵過程中的染菌概率，同時沒有任何有毒 代謝物質(zhì)，保證了該蛋白作為食品添加劑的安全。
【附圖說明】
[0020] 圖1是不同溫度不同時間下熱處理蛋白電泳圖。
[0021 ] 圖中，M.-Marker，l-未熱處理的蛋白，2-65°C熱處理4h，3-65°C下熱處理6h，4-75 °C熱處理6h，5-70°C熱處理8h，6-70°C熱處理6h，7-80°C熱處理2h。
【具體實施方式】：
[0022]為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0023] 實施例1
[0024] 單鏈monellin突變基因蛋白的制備
[0025] (1)野生型單鏈monellin蛋白載體的構(gòu)建
[0026] 由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成野生型單鏈monellin全基因并在兩端分別引 物Xho I和No11兩個限制性內(nèi)切酶位點，經(jīng)過酶切目的基因片段和PGAPZaA空質(zhì)粒，用T4DNA 連接酶37°C連接過夜，轉(zhuǎn)化入DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中涂布于含25μg/ml Zeocin的LLB 固體培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)挑取陽性轉(zhuǎn)化子，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒測序驗證，成功構(gòu)建 野生型monel 1 in蛋白載體PGAPZaA-SCM。
[0027] (2)對野生型單鏈monellin蛋白定點突變
[0028]用Xhol和Notl兩種限制性內(nèi)切酶將目的基因片段切下，反映體系如下： PGAPZaA-SCM 模板 ]〇μ L Xhol 2. 5 μ L Not I 2, ημ L
[0029] 10 x Fast Digest： Buffer 5μ L ddI12() 丨0μ L 總體系 50μ L
[0030] 將酶切體系在37°C酶切6h，酶切后用2%瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因和質(zhì)粒載 體，采用膠回收試劑盒純化目的DNA片段;針對突變位點設(shè)計一對特異性引物 :上游？1:[5'_ CCCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGGTAACTGGGAG-3 ^下游戸之：^'-TTGCGGCCGCTTAGGGAGGAGGCACAGGTCCGTTG-3 ' ];上游引入Xhol位點，下游引入Notl位點，根 據(jù)以下體系進行PCR反應(yīng)： l〇x Reaction buffer 5.0 μι dNTPs (2· 5mM) 5. 0 μ,Ι 上游引物（ ΙΟμΜ) 1.0 μL 上游引物（10μΜ) 1. 0 μL
[0031] 模板(SCM) 1.0 μL EasyPfu (5U/pL) 1,0 μL ddE20 36. 0 μΙ, 總體系 50 μL
[0032] 上述PCR反應(yīng)按照如下程序進行：
[0033] 95°C 預(yù)變性 5min; 95°C 變性 30s，53°C 退火 30s，72°C 延伸 lmin，30 個循環(huán);72°C 終延 伸1 Omi η。PCR結(jié)束后用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物用Xho I和No 11兩種限制性內(nèi)切 酶處理6h后和膠回收的開環(huán)質(zhì)粒載體用T4DNA連接酶37°C下連接過夜，具體反應(yīng)體系如下： 定