，反應(yīng)體系如下：
[0026] PCR反應(yīng)總體系為50yL，包括蒺藜苜蓿cDNA(50ng) lyL;dNTP(2 · 5mM)2 · 5yL;引物F (ΙΟμΜ) lyL;引物R( ΙΟμΜ) lyL; Q5(NEB)酶（5U/yL)0 · 3yL; 5 X 緩沖液 10yL;ddH20 34yL，共50μ UPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5111丨11，951€3〇8,581€3〇8,72 1€6〇8,35個(gè)循環(huán)；最后721€ 10min〇
[0027] 獲得的蒺藜苜蓿STF基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
[0028] 實(shí)施例2轉(zhuǎn)STF基因水稻的獲得
[0029]根據(jù)STF的序列信息，在其CDS兩端設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，正向引物？：5'_ ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcATGTGGATGGTGGGTTACAAT-3，；反向弓丨物1?:5'-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctaTCAGTTTTTCAAGGGAAGAAACT-3 '。以實(shí)施例 1 中得到的 核苷酸序列為模板，進(jìn)行PCR獲得STF全序列（如序列表SEQ ID從).2所示）。
[0030] 將PCR產(chǎn)物通過BP反應(yīng)連接到含有Gateway接頭的PD0NR207中間載體上，經(jīng)測序鑒 定得到與目的STF完全相同的序列。再通過LR反應(yīng)將STF-pD0NR207重組至改造過的過表達(dá) 載體pMDC32-pUbi (將pMDC32載體上35S啟動(dòng)子通過酶切方法換成玉米Ubiquitin啟動(dòng)子 上），獲得載體Ubi: :STF。將過表達(dá)載體Ubi: :STF導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株AGL1中。
[0031] 將野生型水稻日本晴的成熟種子脫殼滅菌，接種到誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3周 后，從盾片處生長出愈傷組織，挑選生長旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷組織，用作轉(zhuǎn) 化的受體。用含有載體Ubi ::STF的重組農(nóng)桿菌菌株侵染野生型水稻愈傷組織。在黑暗處共 培養(yǎng)后，在含有潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷，并在隨后的分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化 獲得轉(zhuǎn)基因植株。將潮霉素抗性植株在陰涼處煉苗，后移栽到水田中。提取水稻旗葉葉片 RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過Q-PCR方法檢測STF過表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻植株中STF基因的表達(dá)量。ΟΡΟ? 引物為 qPCR-F: AATGAATCTGATCAAACCCTTCAAC; qPCR-R: TGCATTGATTGCTGAAGCTGATAT 。 目 前檢測工作已經(jīng)完成，并獲得了表達(dá)量不同的轉(zhuǎn)基因植株(附圖1)。將獲得的轉(zhuǎn)基因陽性植 株根據(jù)表達(dá)量的高低分為三類，依次為表達(dá)量較低的STFI類（以STF0E1為代表），表達(dá)量適 中的STFII類（以STF0E6為代表）以及表達(dá)量較高的STFm類（以STF0E30為代表），并對這些 株系進(jìn)行了幼苗時(shí)期和成熟時(shí)期表型分析。
[0032] 實(shí)施例3 STF基因功能分析
[0033]按照實(shí)施例2的方法獲得的30株STF水稻轉(zhuǎn)基因植株，將這些材料種入大田，根據(jù) 表達(dá)量的高低分為三類，選擇3株代表性轉(zhuǎn)基因植株，分別在幼苗期和成熟抽穗期對葉片和 穗型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，表達(dá)量適中的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為葉片變寬的表型，而表達(dá)量過高的轉(zhuǎn) 基因植株的葉片發(fā)生嚴(yán)重蜷曲（如附圖2)。表明STF在改變水稻葉片發(fā)育的過程中起著重要 作用。選擇對照材料和STF過表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料孕穗期旗葉，利用光合效率測定儀LI6400xt檢 測對照材料和STF過表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料旗葉的光合效率，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因水稻的光合效率與 野生型相比，光合效率約提高30%以上。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)STF水稻植株的莖桿粗壯，與 對照植株相比內(nèi)徑增加至少30%以上，顯著增加水稻植株的抗倒伏能力。
[0034]以上公開的僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，但是，本發(fā)明并非局限于此，任何本領(lǐng)域的 技術(shù)人員能思之的變化都應(yīng)落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 蒺藜苜蓿葉片發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白STF，序列如SEQ ID N0.1所示。2. 權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因，序列如SEQ ID NO.2所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于，所述基因?yàn)槿缦轮兄辽僖环N： 1. SEQ ID勵(lì).2所示的0嫩分子； 2) 在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA 分子。4. 含權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或者重組菌。5. -種過表達(dá)載體，該載體是將SEQ ID NO. 2所述的序列通過BP反應(yīng)連接到含有 Gateway接頭的pD0NR207中間載體上，再通過LR反應(yīng)將STF-pD0NR207重組至改造過的過表 達(dá)載體pMDC32-pUbi ;所述重組至改造過的過表達(dá)載體pMDC32-pUbi是將pMDC32載體上35S 啟動(dòng)子通過酶切方法換成玉米Ubiquitin啟動(dòng)子。6. -種改變植物葉片，莖桿性狀的方法，包括如下步驟:使植物中表達(dá)權(quán)利要求1所述 的蛋白。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的改變植物葉片，莖桿性狀的方法，其特征在于，所述表達(dá)權(quán)利 要求1蛋白的方法為:將權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株AGL1中，侵染植物，獲得 轉(zhuǎn)基因植物。8. 所獲得的具有上述表型特征的轉(zhuǎn)基因材料。9. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述植物為水稻。10. 權(quán)利要求1所述的蛋白在提高植物光合作用效率和抗倒伏方面的應(yīng)用，其特征在 于，所述植物為水稻。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蒺藜苜蓿葉片發(fā)育調(diào)節(jié)基因STF及其編碼蛋白，其具有如SEQ？ID？No.2所示的核苷酸序列和SEQ？ID？No.1所示的氨基酸序列。過表達(dá)蒺藜苜蓿葉片發(fā)育調(diào)節(jié)基因STF可明顯改良單子葉作物(水稻)的葉片和莖稈兩大重要農(nóng)藝性狀，STF基因過表達(dá)水稻材料葉片變寬加厚，莖稈粗壯，顯著提高水稻的光合效率和抗倒伏能力，可用于解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上水稻等單子葉作物光合效率低、莖稈軟弱，易倒伏等問題。
【IPC分類】C07K14/415, C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00
【公開號(hào)】CN105566472
【申請?zhí)枴緾N201610127865
【發(fā)明人】林浩, 牛麗芳, 王慧, 劉斌, 孟穎穎
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年3月7日