一種林蛙油中抗氧化蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種林蛙油中抗氧化蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 林蛙是集食、藥、補(bǔ)等多方面用途于一體的珍貴經(jīng)濟(jì)蛙種，在我國(guó)主要分布在東 北、華北及西部地區(qū)。林蛙雌蛙的輸卵管經(jīng)采制干燥即為林蛙油，俗稱(chēng)雪蛤膏、哈蟆油，在我 國(guó)有上千年的歷史，醫(yī)學(xué)上素有"軟黃金"、"動(dòng)物人參"之美譽(yù)。林蛙油的成分較為復(fù)雜，包 括蛋白質(zhì)、脂肪酸類(lèi)、激素類(lèi)、磷脂類(lèi)、固醇類(lèi)、維生素類(lèi)、核酸類(lèi)物質(zhì)以及多種微量元素等， 其中主要成分為蛋白質(zhì)，占總量的56.13%。
[0003] 林蛙油具有比較廣泛的藥用功效，至今已有許多關(guān)于林蛙油藥理活性的研究。在 林蛙油的抗氧化藥理研究方面主要得到以下結(jié)論:林蛙油具有體外抑制小鼠肝勻漿內(nèi)過(guò)氧 化脂質(zhì)生產(chǎn)，延長(zhǎng)果蠅的平均壽命且使果蠅在低溫下的存活率提高，使小白鼠肝、腦過(guò)氧化 脂質(zhì)含量下降，血漿超氧化物歧化酶(S0D)的活性增高等作用。對(duì)林蛙油也做過(guò)小鼠活體實(shí) 驗(yàn)，用其對(duì)急性衰老的小鼠進(jìn)行灌胃后，小鼠血清中的S0D、GSH-PX的活性有所提高，肝組織 中MAD的量降低。
[0004] 所以林蛙油具有極高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值，對(duì)林蛙油中的抗氧化活蛋白的提取方法 亟待開(kāi)發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種林蛙油中抗氧化蛋白的制備方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0007] -種林蛙油中抗氧化蛋白的制備方法，所述的制備方法為:將泡發(fā)后的林蛙油用 液氮研磨成粉，加入裂解液裂解后并進(jìn)一步采用超聲裂解，然后加入磷酸緩沖液、蛋白酶抑 制劑和核酸酶，浸泡后離心，收集上清液;在上清液中加入硫酸銨，充分沉淀后，離心，收集 沉淀;將沉淀用磷酸緩沖液溶解后，通過(guò)葡聚糖凝膠G-100柱層析分離，收集分離組分，得到 具有林蛙油中的抗氧化蛋白溶液。
[0008] 所述制備方法的具體步驟如下：
[0009] (1)林蛙油干品的泡發(fā):在林蛙油干品中加入純凈水，于2-6 °C下泡發(fā)8_16h，獲得 泡發(fā)后的林蛙油；
[0010] (2)林蛙油中粗蛋白的提取:泡發(fā)后的林蛙油在液氮中研磨至粉末，加入裂解液和 蛋白酶抑制劑，在冰上孵育20_40min，然后采用超聲法對(duì)其進(jìn)一步裂解，獲得林蛙油裂解 液;向林蛙油裂解液中加入磷酸緩沖液、蛋白酶抑制劑和核酸酶，在溫度為2-6 °C下，浸泡8-16h后，離心收集上清，獲得林蛙油粗蛋白提取液；
[0011] 首先用液氮研磨使泡發(fā)后的林蛙油組織塊分散;其次使用裂解液處理，裂解液中 的表面活性劑破壞脂質(zhì)雙分子層，破裂細(xì)胞并溶解蛋白，裂解液中含有的蛋白酶抑制劑能 抑制蛋白酶活性;最后用超聲粉碎進(jìn)一步破碎，使細(xì)胞器及細(xì)胞核內(nèi)的蛋白釋放出來(lái);超聲 粉碎時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量熱量，導(dǎo)致蛋白變性斷裂，因此超聲不宜過(guò)于劇烈，并在冰浴條件下超 聲;若超聲時(shí)管壁發(fā)熱，則冰浴冷卻后再繼續(xù)超聲
[0012] (3)林蛙油粗蛋白的沉淀：向林蛙油粗蛋白提取液中加入硫酸銨固體，使硫酸銨的 終濃度為20-30%，并攪拌使酸銨固體完全溶解后，于2-6°C下靜置8-16h，離心收集沉淀，獲 得林蛙油粗蛋白；
[0013] (4)林蛙油中抗氧化蛋白的分離:將林蛙油粗蛋白用磷酸緩沖液溶解后，采用葡聚 糖凝膠G-100柱層析分離，收集柱流出物為150-200mL部分的液體，得到林蛙油中的抗氧化 蛋白溶液。
[0014] 步驟(2)中所述超聲法裂解的條件為:超聲功率為250-350W，超聲模式為間隔2-3S 超聲2-3s，累計(jì)超聲時(shí)間為2-3min。
[0015] 所述磷酸緩沖液的濃度為l〇-l〇〇mm〇l/L，pH為7。
[0016] 步驟(2)與步驟(3)中所述離心的轉(zhuǎn)速為8000-12000rpm/min，離心15_25min。
[0017] 所述葡聚糖凝膠G-100柱層析分離的條件為:層析柱的規(guī)格為1.6X 100cm，洗脫液 為純水，洗脫液流速為8-12cm/h。
[0018] 所述的一種林蛙油中抗氧化蛋白的制備方法所制備的抗氧化蛋白溶液，其特征在 于，所述的抗氧化蛋白溶液用鄰苯三酚法測(cè)定，抑制率大于45 X 10一2。
[0019 ]所述的一種林蛙油中抗氧化蛋白的制備方法所制備的抗氧化蛋白溶液，其特征在 于，所述的抗氧化蛋白溶液用胰蛋白酶解后獲得了三種抗氧化活性蛋白，分別為Q6DDC2、 F6UKQ6和Q28E35。
[0020] 本發(fā)明的有益效果為:所述的制備方法簡(jiǎn)單、高效、安全而且重復(fù)性好；用該方法 獲得的抗氧化蛋白溶液，具有活性高的特點(diǎn)，用鄰苯三酚法測(cè)定的抑制率在45 X 1 0-2以上， 用胰蛋白酶對(duì)其進(jìn)一步酶解后獲得了三種抗氧化活性蛋白，分別為Q6DDC2、F6UKQ6和 Q28E35,將獲得的抗氧化蛋白直接包裝或經(jīng)過(guò)冷凍干燥后得到林蛙油蛋白成品，可廣泛用 于食品、保健品和食品添加劑中。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為林蛙油中抗氧化活性蛋白Q6DDC2的二級(jí)質(zhì)譜圖。
[0022]圖2為林蛙油中抗氧化活性蛋白F6UKQ6的二級(jí)質(zhì)譜圖。
[0023]圖3為林蛙油中抗氧化活性蛋白Q28E35的二級(jí)質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，以下的實(shí)施例便于更好地理解本 發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法;所用的 材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所用的胰蛋白酶購(gòu)于西 格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。
[0025] 實(shí)施例1:林蛙油中抗氧化蛋白溶液的提取及活性鑒定
[0026] (1)林蛙油干品的泡發(fā)
[0027]取lg林蛙油干品，加入200mL純凈水，于4°C下泡發(fā)過(guò)夜，獲得泡發(fā)后的林硅油；經(jīng) 泡發(fā)后的林蛙油色澤偏白，肉厚，帶有清淡的魚(yú)腥味，體積為干品的40-60倍。
[0028] (2)林蛙油中粗蛋白的提取
[0029]取泡發(fā)后的林硅油放入研缽中，加入液氮研磨至粉末，加入100mL裂解液和lmL蛋 白酶抑制劑，冰上孵育