抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型病毒性肝炎（簡稱乙型肝炎)是由乙肝病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染引 起的全球性重大公共衛(wèi)生問題，也是最常見的肝病病因。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球有20億 人曾感染過HBV，其中約有3億人發(fā)展成為HBV慢性感染者。HBV慢性感染是導(dǎo)致肝硬化和肝 癌的主要原因，世界上約有1/3的肝硬化患者和3/4以上的肝癌患者是由乙型肝炎慢性感染 所致。每年有近100萬人死于HBV慢性感染引起的肝硬化或肝癌等疾病。中國是HBV感染的高 發(fā)地區(qū)，目前中國有9300萬HBV慢性感染人群。近年來，隨著乙肝疫苗的推廣，新發(fā)乙型肝炎 數(shù)量減少，但中國每年仍有10萬例新發(fā)HBV感染者。乙型肝炎防控的難度不容忽視。乙肝表 面抗原(HBsAg)定量檢測是評價慢乙肝治療效果的重要手段。中華醫(yī)學(xué)會發(fā)布的2015年版 《慢性乙型肝炎防治指南》指出：對血清中的乙肝表面抗原進行定量監(jiān)測，可用于預(yù)測疾病 進展、抗病毒療效和預(yù)后，停藥后獲得持久的HBsAg消失為慢乙肝治療的理想終點。欲評估 慢乙肝HBsAg是否消失，則要求對HBsAg的定量達到精確的水準(zhǔn)。受技術(shù)所限，HBsAg的檢測 一直處于手工定性或者半定量狀態(tài)。最近，國外的公司有通過化學(xué)顯色的方法來定量 HBsAg，然而化學(xué)顯色方法靈敏度滴，檢測不到血液中低豐度的HBsAg，會給HBsAg的檢測帶 來誤判。熒光發(fā)光檢測的方法比化學(xué)顯色靈敏10000倍以上，可以檢測到樣本中單個拷貝的 靶標(biāo)的檢測。
[0003] 基于此，有必要設(shè)計一種抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法，用來大幅度提 高HBsAg檢測的靈敏度，實現(xiàn)HBsAg的精確定量檢測，輔助加強對乙型肝炎的發(fā)病的監(jiān)控力 度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法，旨在提高 HBsAg的檢測靈敏度、性質(zhì)穩(wěn)定性和特異性，適用于HBsAg的精確定量檢測。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法，所述 抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法包括如下步驟：
[0006] 51:獲得183冰64?711?突變庫；
[0007] S2:獲得香豆素賴氨酸；
[0008] S3:篩選特異識別7-羥基香豆素的吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶(CouKRS)突變體；
[0009] S4:將步驟S3中的吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶突變體的編碼基因 coukrs與畢赤 酵母表達質(zhì)粒pPICZ重組，獲得酵母表達質(zhì)粒pPICZ-CouKRS;
[0010] S5:設(shè)計抗HBsAg抗體的突變DNA序列，獲得該突變體，將所述抗HBsAg抗體的突變 DNA序列與質(zhì)粒pPIC9K重組，獲得酵母表達質(zhì)粒PPIC9K-antiHBsAg;
[0011] S6:將步驟S4獲得的pPICZ-CouKRS線性化，將步驟S5獲得的PPIC9K-antiHBsAg線 性化；
[0012] S7:將步驟S6線性化后的pPICZ-CouKRS和線性化后的pPIC9K-antiHBsAg按照第一 預(yù)設(shè)的比例混合，經(jīng)過電擊轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入到畢赤酵母X33中，獲得菌株A;
[0013] S8:將步驟S7獲得的菌株A進行抗性篩選，獲得陽性菌株組B;
[0014] S9:將步驟S8獲得的陽性菌株組B分別進行PCR篩選鑒定，獲得若干個陽性菌株組 C；
[0015] S10:將步驟S9獲得的陽性菌株組C中的單克隆酵母，涂布于含有G418的YPDS固體 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以驗證所述單克隆酵母的G418抗性，若驗證成功，則獲得具備識別并攜帶7-羥基香豆素插入到抗乙肝表面抗原抗體的63位點的單克隆酵母D;
[0016] S11:將步驟S10獲得的單克隆酵母D擴大培養(yǎng)、離心、超聲破碎以及鎳柱純化得到 抗乙肝表面抗原熒光抗體。
[0017] 優(yōu)選地，所述步驟S1包括如下步驟：
[0018] 5101:人工合成18&吐64?711?的0嫩序列；
[0019] S102:將上述合成的M.Barkeri PylRS的DNA序列連接到pBK質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒 A；
[0020] S103:設(shè)計定點突變引物，所述定點突變引物包括引物f-Y349D、引物r-Y349D、引 物f-L2701、引物r-L2701、引物f-N311F313NNK、引物r-N311F313NNK、引物f-Y349NNK和引物 Γ-Υ349ΝΝΚ；
[0021] S104:以所述重組質(zhì)粒A為模板，以所述引物f-Y349D和引物r-Y349D為引物，通過 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得突變庫1;
[0022] S105:以所述突變庫1為模板，以所述引物f-L270I和引物r-L270I為引物，通過聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得突變庫2;
[0023] S106:以所述突變庫2為模板，以所述引物f-N311F313NNK和引物r-N311F313NNK為 引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得突變庫3;
[0024] S107:以所述突變庫3為模板，以所述引物f-Y349NNK和引物r-Y349NNK為引物，通 過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得突變庫4;
[0025] S108:所述突變庫1、突變庫2、突變庫3和突變庫4按照第二預(yù)定的比例混合，獲得 用于7-羥基香豆素篩選用的M.Barkeri PylRS突變庫。
[0026]優(yōu)選地，所述第一預(yù)定的比例為1:1。
[0027]優(yōu)選地，所述步驟S2包括如下步驟：
[0028] S21:取第一預(yù)設(shè)量的間苯二酚，溶于水中，并加熱到90°C，滴加第二預(yù)設(shè)量的蘋果 酸，反應(yīng)2小時后即可得到7-羥基香豆素 A;
[0029] S22:取第三預(yù)設(shè)量的上述7-羥基香豆素 A、賴氨酸和LiCl水溶液于60°C攪拌，經(jīng)過 12小時;經(jīng)液相色譜分離，濾膜過濾除菌，得到7-羥基香豆素母液C。
[0030] 優(yōu)選地，所述7-羥基香豆素母液C經(jīng)過0.22微米濾膜過濾除菌。
[0031 ] 優(yōu)選地，所述7-羥基香豆素母液C的濃度設(shè)定為100mM。
[0032] 優(yōu)選地，所述步驟S8包括如下步驟：
[0033] S81:將步驟S7獲得的菌株A培養(yǎng)兩個小時后涂布在含ZeocinTM和氨芐霉素的YPDS 平板上，30°C培養(yǎng)3天，獲得多個單克隆菌株；
[0034] S82:將步驟S81獲得的多個單克隆菌株挑取到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)。 獲得陽性菌株組B
[0035] 優(yōu)選地，所述步驟S9包括如下步驟：
[0036] S91:取步驟S82獲得的陽性菌株組B擴增的酵母菌液分別置于離心管中離心，獲得 酵母沉淀組1;
[0037] S92:將步驟S91獲得的酵母沉淀組1加入無菌水，漩渦震蕩重懸，獲得酵母沉淀組 2；
[0038] S93:將所述酵母沉淀組2分別置于-80°C的冰箱，30min后取出，室溫下融化；
[0039] S94:重復(fù)步驟S93-次，分別離心取上清液獲得酵母溶液組3;
[0040] S95:取酵母溶液組3，分別置于PCR擴增儀上進行PCR擴增，驗證步驟S82中的單克 隆的正確性，獲得若干個陽性菌株組C。
[0041 ] 優(yōu)選地，所述步驟S4在畢赤酵母表達質(zhì)粒pPICZ的EcoRI和Xbal酶切位點之間插入 吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶突變體的編碼基因 coukrs，獲得酵母表達質(zhì)粒pPICZ-CouKRS。
[0042] 優(yōu)選地，所述步驟S5在質(zhì)粒pPIC9K的EcoRI和Notl酶切位點之間插入抗HBsAg抗體 的突變DNA序列，獲得酵母表達質(zhì)粒pPIC9K-antiHBsAg。
[0043] 本發(fā)明提供的抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法通過合成M. Barker i物種的 吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶(PylRS)的DNA序列，并將所述DNA序列連接到pPICZ質(zhì)粒上;通 過設(shè)計抗HBsAg抗體的突變DNA序列，獲得該突變體，將所述抗HBsAg抗體的突變DNA與質(zhì)粒 PPIC9K重組，獲得酵母表達質(zhì)粒pPIC9K-antiHBsAg;通過將線性化質(zhì)粒pPICZ-CouKRS、 PPIC9K-antiHBsAg按照一定的比例混合，電擊轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入到畢赤酵母X33中，進行篩選和驗 證，獲得了制備抗乙肝表面抗原熒光抗體的真核生物表達系統(tǒng)，該系統(tǒng)介導(dǎo)7-羥基香豆素 在抗乙肝表面抗原抗體的氨基酸序列的63位點插入，從而實現(xiàn)了抗乙肝表面抗原熒光抗體 的制備;大幅度提高HBsAg檢測的靈敏度，輔助實現(xiàn)HBsAg的精確定量檢測，加強了對乙型肝 炎的發(fā)病的監(jiān)控力度。
【附圖說明】
[0044] 圖1為本發(fā)明抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法的流程示意圖；
[0045] 圖2為本發(fā)明抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法的步驟S1的流程示意圖；
[0046] 圖3為本發(fā)明抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法的步驟S2的流程示意圖； [0047]圖4為本發(fā)明香豆素賴氨酸的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0048]圖5為本發(fā)明抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法的步驟S8的流程示意圖； [0049]圖6為本發(fā)明抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法的步驟S9的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0050] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解 釋，本發(fā)明并不局限于以下實施例。
[0051] 本發(fā)明提供的抗乙肝表面抗原的熒光抗體的制備方法，所述抗乙肝表面抗原的熒 光抗體的制備方法包括如下步驟：
[0052] 51:獲得18&『1?^1?711?突變庫；
[0053] S2:獲得香豆素賴氨酸；
[0054] S3:篩選特異識別7-羥基香豆素的吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶(CouKRS)突變體；
[0055] S4:將步驟S3中的吡咯賴氨酸氨酰-tRNA合成酶突變體的編碼基因 coukrs與畢赤 酵母表達質(zhì)粒p