用于檢測氟苯尼考的單克隆抗體及酶聯(lián)免疫方法與試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于獸藥殘留分析和免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能識別氟苯尼考的單 克隆抗體，以及用于檢測氟苯尼考的酶聯(lián)免疫方法(ELISA)與試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 氟苯尼考屬于氯霉素類化合物，主要用于治療動物呼吸道和腸道感染。氟苯尼考 有一定的胚胎毒性，中國、美國、日本及歐盟等許多國家和組織都規(guī)定了其在動物組織中的 最大殘留限量。目前儀器分析的方法雖然能夠達到對氟苯尼考的檢測要求，但是儀器昂貴、 樣品前處理繁瑣、對操作人員要求也很高。免疫化學(xué)分析法特別是酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù) 具有快速、靈敏度高、操作簡單、適應(yīng)性強等優(yōu)點，適合高通量樣品篩選，與儀器檢測方法相 比，ELISA方法更具優(yōu)勢。
[0003] 酶聯(lián)免疫吸附法是以抗原抗體的特異性反應(yīng)原理進行檢測的生物技術(shù)，由于它是 一種簡單、靈敏度高、特異性好的檢測方法，因此得到了廣泛的應(yīng)用。目前國內(nèi)外已有關(guān)于 氟苯尼考抗體制備方法的報道:Luo(2009)建立了檢測豬肉中的氟苯尼考和氟苯尼考胺的 殘留方法，以氟苯尼考胺為半抗原，采用甲醛偶聯(lián)法進行免疫原合成，得到了一株可以識別 氟苯尼考和氟苯尼考胺的多克隆抗體。孫法良等(2009)建立了雞肉當中氟苯尼考的殘留檢 測方法，以氟苯尼考琥珀酸酐為半抗原，通過琥珀酸酐法合成免疫原，得到了一株多克隆抗 體，對氟苯尼考IC 5Q為79.3yg/L。馮才茂等（2012)以氟苯尼考胺為半抗原，采用碳二亞胺法 合成完全抗原，制備的多克隆抗體最低檢測限為〇. 5yg/L，對氟苯尼考交叉反應(yīng)率為150%。 朱愛榮等(2015)以氟苯尼考胺為半抗原，通過戊二醛法合成抗原，最終獲得了能夠識別氟 苯尼考的多克隆抗體。沈建忠等(2008)申請了一種檢測氟苯尼考及氟苯尼考胺的方法及其 專用酶聯(lián)免疫試劑盒的專利，以氟苯尼考胺為半抗原，通過EDC方法合成免疫原，最終獲得 了能夠同時識別氟苯尼考和氟苯尼考胺的多克隆抗體。深圳市綠詩源生物科技有限公司于 2009年申請了一種氟苯尼考類藥物快速檢測試劑盒的專利，其中以氟苯尼考琥珀酸酐作為 半抗原，通過混合酸酐法合成免疫原，通過免疫小鼠或者新西蘭大白兔從而獲得能夠識別 氟苯尼考的單克隆抗體或者多克隆抗體。由上可見，目前文獻報道的多為多克隆抗體，多克 隆抗體雖然靈敏度較高，但是批間變異大，沒有單克隆抗體性質(zhì)穩(wěn)定。另外，現(xiàn)有的單克隆 或多克隆抗體識別的專屬性和靈敏度較低，無法特異性地識別氟苯尼考，且識別的1(： 50過 尚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的為：
[0005] (1)提供一種能特異性識別氟苯尼考的單克隆抗體；
[0006] (2)提供所述單克隆抗體在制備檢測氟苯尼考藥物殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒中的應(yīng) 用；
[0007] (3)提供一種含有所述單克隆抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒；
[0008] (4)提供所述酶聯(lián)免疫試劑盒在氟苯尼考藥物殘留非診斷目的檢測中的應(yīng)用；
[0009] (5)利用該單克隆抗體，建立一種氟苯尼考藥物殘留非診斷目的檢測的ELISA方 法；
[0010] ⑻提供一種所述的ELISA方法在氟苯尼考藥物殘留非診斷目的檢測中的應(yīng)用。
[0011]上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0012] -種能識別氟苯尼考單克隆抗體，它是由保藏號為CCTCC N0:C201548的雜交瘤細 胞株FF/7A8所分泌的。
[0013] 所述的雜交瘤細胞株FF/7A8，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC N0:C201548。
[0014] 所述的單克隆抗體是以氟苯尼考胺(FFA)與琥珀酸酐(HS)反應(yīng)后得到的氟苯尼考 胺半琥珀酸酯(FFA-HS)與載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物作為免疫原制備得到的。本發(fā)明優(yōu)選 的免疫原載體蛋白是血藍蛋白（KLH)。
[0015] 所述的單克隆抗體可用于制備檢測氟苯尼考的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0016] -種包含所述的單克隆抗體的試劑盒，該試劑盒是檢測氟苯尼考藥物殘留的酶聯(lián) 免疫試劑盒。
[0017] 所述的試劑盒可用于氟苯尼考藥物殘留非診斷目的的檢測。
[0018] 本發(fā)明進一步提供一種氟苯尼考藥物殘留的非診斷目的酶聯(lián)免疫檢測方法，該方 法包括以下步驟：
[0019] (1)將氟苯尼考胺(FFA)與琥珀酸酐(HS)反應(yīng)后的氟苯尼考胺半琥珀酸酯(FFA-HS)與載體蛋白偶聯(lián)，將得到的偶聯(lián)物作為免疫原；
[0020] (2)將氟苯尼考胺(FFA)與載體蛋白偶聯(lián)得到包被原；
[0021] (3)用步驟（1)的免疫原制備得到保藏號為CCTCC NO:C201548的雜交瘤細胞株FF/ 7A8；
[0022] (4)用保藏號為CCTCC N0:C201548的雜交瘤細胞株FF/7A8制備單克隆抗體；
[0023] (5)用步驟(2)的包被原包被固相載體；
[0024] (6)樣品處理和檢測。
[0025] 優(yōu)選地，免疫原載體蛋白是血藍蛋白（KLH)，包被原載體蛋白是卵清白蛋白（0VA)。
[0026] 本發(fā)明的有益效果是：
[0027] 1、本發(fā)明在抗體制備時，采用氟苯尼考胺與琥珀酸酐反應(yīng)，得到氟苯尼考胺半琥 珀酸酯，將其作為半抗原并與載體蛋白偶聯(lián)后作為免疫原，由該免疫原制備的單克隆抗體 能夠特異性地識別氟苯尼考。
[0028] 2、本發(fā)明的試劑盒和酶聯(lián)免疫檢測方法可用于檢測動物性食物如豬肉、雞肉、魚、 豬肝臟和雞肝臟中的氟苯尼考藥物殘留，而且檢測靈敏度、準確度高，精密度好，IC 5Q值僅為 0.21±0.02yg/L。
[0029] 3、本發(fā)明所涉及的檢測方法簡單，易操作，檢測成本低，對操作者身體健康危害相 對較小。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明的單克隆抗體與氟苯尼考標準品的間接競爭ELISA反應(yīng)曲線圖，X軸 為氟苯尼考(FF)標準溶液濃度對數(shù)值，Y軸為氟苯尼考標準品溶液的光密度值除以"零"孔 光密度值(Β/Βο)。
【具體實施方式】
[0031 ]下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明，但不限制本發(fā)明。
[0032]實施例1免疫原和包被原的制備
[0033] 1.3氟苯尼考胺半琥珀酸酯與血藍蛋白偶聯(lián)物(FFA-HS-KLH)的制備
[0034] 稱取氣苯尼考胺(FFA)247mg( lmmol)，B0C酸圈lmmol)，Na2C〇3l06mg( lmmol) 于50mL圓底燒瓶中，加入二氯甲烷10mL，室溫反應(yīng)過夜。過濾，除掉Na2C03,然后加入琥珀酸 酐200mg(2mmol)，三乙胺lmL，60°C油浴條件下，回流反應(yīng)Id。蒸干除掉二氯甲燒，加三氟乙 酸2mL，室溫水浴反應(yīng)2-4h，待反應(yīng)完全滴加三乙胺調(diào)中性，用乙酸乙酯洗滌2-3次，合并有 機相，無水硫酸鎂脫水后，蒸干得到黃色油狀物，即半抗原氟苯尼考胺半琥珀酸酯（FFA-HS)。反應(yīng)式如下：
[0035] ^ Ο
\ -
[0036] 稱取氟苯尼考胺半琥珀酸酯69.4mg，溶于lmL DMF中，加入DCC 60mg和N-羥基琥珀 酰亞胺(NHS) 34.6mg，室溫避光反應(yīng)8h，反應(yīng)完全過濾得到A液。取3mLKLH溶于3mL PBS中，為 B液。冰浴條件下，將A液緩慢滴加到B液中，4°C反應(yīng)8-10h。將產(chǎn)物裝入透析袋內(nèi)，4°C條件下 用PBS透析5d，每天更換透析液3次。得到的即為FFA-HS-KLH。
[0037]
[0038] 1.4氟苯尼考胺卵清白蛋白偶聯(lián)物(FFA-EDC-0VA)的制備
[0039] 稱取氟苯尼考胺24.7mg，溶于100yL DMF中為A液。稱取40mg 0VA溶于6mL PBS中， 為B液。將A液緩慢滴加到B液中，然后加入EDC 16mg和NHS 12mg。室溫反應(yīng)過夜。將反應(yīng)物裝 入透析袋內(nèi)，4 °C用roS透析5d，每天更換透析液3次。得到的即為完全抗原FFA-EDC-0VA。反 應(yīng)式如下： 0H
[0040] " 〇
[0041] 實施例2單克隆抗體的制備
[0042] 2.1動物免疫
[0043]利用發(fā)明人所在的國家獸藥殘留基準實驗室制備的免疫原（FFA-HS -KLH)免疫 Balb/C小鼠（購自湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心）。免疫程序是取含F(xiàn)FA-HS-KLH偶聯(lián)物50 ~l〇〇yg的蛋白溶液與佐劑等量混合后注入小鼠體內(nèi)，使其產(chǎn)生特異性血清。
[0044] 2.2細胞融合和克隆化
[0045] 參照楊漢春《動物免疫學(xué)》，利用發(fā)明人所在國家獸藥殘留基準實驗室制備的FFA-HS-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠（購自湖北省疾病預(yù)防控制中心實驗動物中心），免疫程序 為:基礎(chǔ)免疫將免疫原與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，于小鼠背部皮下多點注射，以后每 間隔2周加強免疫一次，換用不完全