核酸擴增反應(yīng)裝置和核酸檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸擴增反應(yīng)裝置和核酸檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，因基因利用技術(shù)的發(fā)展，基因診斷、基因治療等利用基因的醫(yī)療受到矚 目，除此之外，在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)領(lǐng)域也開發(fā)出多種將基因用于鑒別品種、改良品種的方法。作 為用于利用基因的技術(shù)，PCR(聚合酶鏈式反應(yīng)，Polymerase Chain Reaction)法等核酸擴 增技術(shù)正在廣泛普及。
[0003] 核酸擴增技術(shù)中，作為同時檢測多個基因的方法，已知有多重PCR(例如，參照專 利文獻1)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)文獻
[0005] 專利文獻
[0006] 專利文獻1 :日本特開2010-207220

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 但是，在多重PCR中，對一個反應(yīng)液中的多個基因進行檢測時，因為使用多個各基 因用引物對，所以為了區(qū)別擴增的基因而需要對應(yīng)基因個數(shù)的不同種類的熒光色素和對應(yīng) 各熒光色素的檢測體系，除此之外，由于各引物間的干涉等而反應(yīng)有時進行不充分，反應(yīng)條 件的構(gòu)建困難。
[0008] 本發(fā)明的課題在于提供一種能夠在一個反應(yīng)體系中對多個基因分別在短時間內(nèi) 正確且簡便地進行檢測的核酸擴增反應(yīng)裝置和核酸檢測方法。
[0009] 本發(fā)明是為了解決上述課題的至少一部分而進行的，能夠以下述方式實現(xiàn)。
[0010] 本發(fā)明的一個實施方式為核酸擴增反應(yīng)裝置，包含：安裝部，可安裝填充有核酸擴 增反應(yīng)液和與核酸擴增反應(yīng)液相比比重小且不與核酸擴增反應(yīng)液混和的液體的核酸擴增 反應(yīng)容器；第1溫度調(diào)整部，對核酸擴增反應(yīng)容器的第1區(qū)域的溫度進行調(diào)整；第2溫度調(diào) 整部，對核酸擴增反應(yīng)容器的第2區(qū)域的溫度進行調(diào)整；和驅(qū)動機構(gòu)，對第1配置和第2配 置進行切換，所述第1配置為第1區(qū)域在重力作用的方向上位于第2區(qū)域的下方、所述第2 配置為第2區(qū)域在重力作用的方向上位于第1區(qū)域的下方；并且，核酸擴增反應(yīng)液含有用于 使第1核酸擴增的第1引物對和用于使第2核酸擴增的第2引物對，第1引物對的對上述 第1核酸的能夠退火的溫度區(qū)域與第2引物對的對第2核酸的能夠退火的溫度區(qū)域的重疊 部分為l〇°C以下，對于上述核酸擴增反應(yīng)液，將第1區(qū)域的溫度調(diào)整為第1溫度，將第2區(qū) 域的溫度調(diào)整為低于第1溫度的第2溫度來進行第1熱循環(huán)后，將第1區(qū)域的溫度調(diào)整為 第3溫度，將第2區(qū)域的溫度調(diào)整為低于第3溫度且與2溫度不同的第4溫度來進行第2 熱循環(huán)。第2溫度可以高于上述第4溫度。第2溫度與第1引物對和上述第1核酸的最佳 退火溫度的溫度差可以為5°C以內(nèi)，并且可以為1°C以內(nèi)。第4溫度與第2引物對和上述第 2核酸的最佳退火溫度的溫度差可以為5°C以內(nèi)，并且可以1°C以內(nèi)。第1熱循環(huán)為重復(fù)第 1溫度和第2溫度的2個階段的溫度變化的熱循環(huán)，在第2溫度中，第1核酸可以擴增且第 2核酸不可以擴增，此外，第2熱循環(huán)為重復(fù)第3溫度和第4溫度的2階段的溫度變化的熱 循環(huán)，在第4溫度中，第2核酸可以擴增且第1核酸不可以擴增。
[0011] 本發(fā)明的另一實施方式為一種核酸檢測方法，使用如下核酸擴增反應(yīng)裝置，即，上 述核酸擴增反應(yīng)裝置包含：安裝部，可安裝填充有核酸擴增反應(yīng)液和與核酸擴增反應(yīng)液相 比比重小且不與核酸擴增反應(yīng)液混和的液體的核酸擴增反應(yīng)容器；第1溫度調(diào)整部，對核 酸擴增反應(yīng)容器的第1區(qū)域的溫度進行調(diào)整、第2溫度調(diào)整部對核酸擴增反應(yīng)容器的第2 區(qū)域的溫度進行調(diào)整；和驅(qū)動機構(gòu)，對第1配置和第2配置進行切換，所述第1配置為第1 區(qū)域在重力作用的方向上位于第2區(qū)域的下方、所述第2配置為第2區(qū)域在重力作用的方 向上位于第1區(qū)域的下方；而且，上述核酸檢測方法包含如下工序：對于如下核酸擴增反應(yīng) 液，將第1區(qū)域設(shè)定為第1溫度，將第2區(qū)域設(shè)定為低于上述第1溫度的第2溫度來進行第 1熱循環(huán)的工序、和在第1熱循環(huán)后，將第1區(qū)域設(shè)定為第3溫度，將第2區(qū)域設(shè)定為低于 第3溫度的且與第2溫度不同的第4溫度而進行第2熱循環(huán)的工序，所述核酸擴增反應(yīng)液 包含用于使第1核酸擴增的第1引物對和用于使第2核酸擴增的第2引物對，且第1引物 對的對第1核酸的能夠退火的溫度區(qū)域與第2引物對的對第2核酸的能夠退火的溫度區(qū)域 的重疊部分為規(guī)定的溫度以下。能夠退火的溫度區(qū)域的重疊部分可以為5°C以下，或者可以 沒有重疊。第1核酸和第1引物對的最佳退火溫度與第2核酸和第2引物對的最佳退火溫 度可以相差：TC以上。核酸擴增反應(yīng)裝置可進一步含有熒光檢測部，在核酸擴增反應(yīng)裝置進 行第1熱循環(huán)和第2熱循環(huán)期間，熒光檢測部對從核酸擴增反應(yīng)液放射出的熒光進行監(jiān)測。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，能夠提供一種在短時間內(nèi)正確且簡便地判斷出多個基因各自有無的 核酸擴增反應(yīng)裝置。具體而言，通過采用本發(fā)明，熒光檢測系和反應(yīng)液可均為1個，因此操 作簡便且能夠抑制成本。此外，也不需要分注操作因此也不產(chǎn)生由分注而致的誤差。而且， 不會出現(xiàn)如下在一個反應(yīng)液中對多個核酸進行擴增時出現(xiàn)的問題：因同時發(fā)生多個核酸擴 增而導(dǎo)致各引物間的相互干涉，從而阻礙擴增反應(yīng)。除此之外，因為監(jiān)測熒光亮度時，能夠 通過熒光亮度的變化來判斷核酸的擴增的有無，所以不需要進一步的溶解曲線分析、電泳 操作，能夠在短時間內(nèi)進行判斷。
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發(fā)明的一個實施方式涉及的核酸擴增反應(yīng)容器的截面圖。g表示重力方 向。
[0014] 圖2是本發(fā)明的一個實施方式涉及的升降式PCR裝置的立體圖。（A)表示關(guān)閉蓋 的狀態(tài)，（B)表示打開蓋的狀態(tài)。
[0015] 圖3是本發(fā)明的一個實施方式涉及的升降式PCR裝置中的主體的分解立體圖。
[0016] 圖4是示意地表示本發(fā)明的一個實施方式涉及的升降式PCR裝置中的主體的沿圖 2㈧的A-A線的截面的截面圖。㈧表示第1配置，（B)表示第2配置。
[0017] 圖5是表示比較例涉及的各引物對的能夠退火的溫度區(qū)域的曲線。
[0018] 圖6是表示本發(fā)明的一個實施方式涉及的本發(fā)明中的各引物對的能夠退火的溫 度區(qū)域的曲線。
[0019] 圖7是表示本發(fā)明的一個實施方式和比較例涉及的各基因的擴增的熒光亮度曲 線。
【具體實施方式】
[0020] 本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點及其構(gòu)思，可通過本說明書的記載能夠使本領(lǐng)域技術(shù)人 員充分了解，根據(jù)本說明書的記載，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員，就能容易地再現(xiàn)本發(fā)明。以下 記載的發(fā)明的實施方式和具體的實施例等表示本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，是用于例示或說明 而示出的，本發(fā)明不限于這些。在本說明書中公開的本發(fā)明的意圖和范圍內(nèi)，基于本說明書 的記載，可以進行各種改變和修飾，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是明確的。
[0021] (1)核酸擴增反應(yīng)容器
[0022] 本發(fā)明的方法中使用的核酸擴增反應(yīng)容器為如下的核酸擴增反應(yīng)容器，即具有含 有反應(yīng)液和比重與反應(yīng)液不同的且發(fā)生相分離的液體的密閉的容器，反應(yīng)液為液滴狀，液 體包含油和添加劑。
[0023] 圖1是核酸擴增反應(yīng)容器100的截面圖。圖1表示核酸擴增反應(yīng)容器中裝入反應(yīng) 液的狀態(tài)。
[0024] 本發(fā)明中使用的核酸擴增反應(yīng)容器100包含容器150和密封部120而構(gòu)成。核酸 擴增反應(yīng)容器100的大小、形狀沒有特別限定，例如，可以考慮不與反應(yīng)液140混和的液體 130的量、熱導(dǎo)系數(shù)、容器150和密封部120的形狀以及操作的容易程度中的至少一個而設(shè) 計得到。
[0025] 核酸擴增反應(yīng)容器100的容器150可以由透明的材質(zhì)形成。因此，可以從核酸擴 增反應(yīng)容器100的外部對容器150內(nèi)的反應(yīng)液140的移動進行觀察，或者可以用于實時PCR 等的從容器150的外部進行測定等的用途。應(yīng)予說明，本說明書中稱為"透明"的情況是指 能夠確保從容器150的外部可對容器150內(nèi)的反應(yīng)液140進行觀察的程度的可視性，只要 滿足該條件，可以不必使核酸擴增反應(yīng)容器100的整體為透明。
[0026] 核酸擴增反應(yīng)容器100的用途沒有特別限定，例如用于實時PCR這樣的伴有熒光 測定的用途時，容器150優(yōu)選由自發(fā)熒光小的材質(zhì)形成。容器150優(yōu)選為可耐受PCR中的 加熱的材質(zhì)。而且，容器150的材質(zhì)優(yōu)選為核酸、蛋白質(zhì)的吸附少且不阻礙基于聚合酶等的 酶反應(yīng)的材質(zhì)。作為滿足這些條件的材質(zhì)沒有特別限定，例如，可以為聚丙烯、聚乙烯、環(huán)烯 烴聚合物（例如，ΖΕ0ΝΕΧ (注冊商標）480R)、耐熱玻璃（例如PYREX (注冊商標）玻璃）等 或這些的復(fù)合材料，優(yōu)選聚丙烯。
[0027] 在圖1所示的核酸擴增反應(yīng)容器100中，容器150形成為圓筒狀，中心軸向（圖1 中的上下方向）為長邊方向。這里使用的容器150優(yōu)選為管，也可以為小型離心用管、作為 PCR用設(shè)計得到的管，但通過具有長邊方向，即為細長的形狀，例如，使用后述的升降型的加 熱循環(huán)器在容器150內(nèi)的液體130中以形成溫度不同的區(qū)域的方式對核酸擴增反應(yīng)容器 100進行溫度控制時，易于使不同溫度區(qū)域之間的距離變長。由此，對應(yīng)容器150內(nèi)的每個 區(qū)域，易于將液體130控制為不同的溫度，所以能夠?qū)崿F(xiàn)適于PCR的熱循環(huán)。應(yīng)予說明，升 降型的加熱循環(huán)器是指通過在充滿容器150的液體中形成至少2個溫度區(qū)域，使與液體相 分離的反應(yīng)液140在這些溫度區(qū)域間往返移動而實現(xiàn)熱循環(huán)的裝置。
[0028] 容器150的形狀只要具有長邊方向，就沒有特別限定，用于升降型PCR時，為大致 圓筒形狀，內(nèi)徑D與長邊方向的長度L之比優(yōu)選為1 :5~1. 5 :20的范圍。而且，內(nèi)徑D更 優(yōu)選為1· 5~2mm，長度L更優(yōu)選為10~20mm〇
[0029] 容器150具有開口部和密封開口部的密封部120,容器150中含有反應(yīng)液140和與 反應(yīng)液140比重不同且相分離的液體130。通過密封部120密封開口部時，優(yōu)選在容器150 內(nèi)不殘留空氣。因為如果在容器150內(nèi)殘留氣泡，則妨礙反應(yīng)液140的移動。密封部120可 由與容器150相同的材質(zhì)形成。密封部120的結(jié)構(gòu)只要是能夠密封容器150的結(jié)構(gòu)即可， 例如，可以為螺旋帽、栓、嵌入等結(jié)構(gòu)。在圖1中，密封部120為螺旋帽的結(jié)構(gòu)。
[0030] 核酸擴增反應(yīng)液140 (以下，亦記為反應(yīng)液140)可含有核酸擴增反應(yīng)用試劑和擴 增對象的靶核酸。作為靶核酸，例如，可舉出由血液、尿、唾液、髓液、組織等被檢測物制備 得到的DNA，或?qū)⒂蛇@些被檢測物制備得到的RNA進