一種防控茄果類蔬菜病毒病的微生物菌劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種防控茄果類蔬菜病毒病的木霉、 芽孢桿菌復(fù)合微生物菌劑及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整步伐的加快和人民生活水平的提高，蔬菜品種的多樣化及 周年均衡供應(yīng)的需求日益增強(qiáng)，我國(guó)蔬菜生產(chǎn)的規(guī)模不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量穩(wěn)步上升，已成為我國(guó) 種植業(yè)中僅次于糧食的第二大農(nóng)作物。據(jù)農(nóng)業(yè)部農(nóng)情統(tǒng)計(jì)，2009年我國(guó)蔬菜種植面積占全 球的43%，總產(chǎn)量占世界的49. 6%?？偖a(chǎn)量及出口量均居世界第一，堪稱世界第一蔬菜大國(guó)。
[0003] 但是隨著我國(guó)蔬菜生產(chǎn)的發(fā)展，栽培模式的多樣性，蔬菜栽培種類和品種的豐富 性，尤其是栽培環(huán)境的多樣化，導(dǎo)致某些次要病害上升，病原菌寄主范圍擴(kuò)大，產(chǎn)生了許多 亟待研究的新病害，一些新老病害交替為害，這些都嚴(yán)重制約著我國(guó)蔬菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中 茄果類蔬菜病毒病，均發(fā)生較為嚴(yán)重，造成嚴(yán)重減產(chǎn)、甚至絕收，已成為蔬菜生產(chǎn)的限制性 障礙。目前防治該類病害仍主要采用化學(xué)藥劑，常常剛用完藥就采收銷售，不僅造成蔬菜污 染，同時(shí)還極易造成抗藥性問(wèn)題。因此研發(fā)安全與環(huán)境相和諧的微生物農(nóng)藥成為必然，其中 木霉、芽孢桿菌這類有益微生物，由于其具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)抗性、廣譜抗病能力和調(diào)節(jié)微生態(tài) 作用，而被研究用于植物病害生物防治和改善作物生長(zhǎng)。
[0004] 木霉、芽孢桿菌是自然界中普遍存在的真菌和細(xì)菌，在土壤、植物根圍、葉圍及種 子、球莖表面經(jīng)?？梢苑蛛x到。近些年人們發(fā)現(xiàn)某些木霉、芽孢桿菌是植物病原真菌的寄生 菌或措抗菌，如哈茨木霉（7 1. Aarzia/??)、鉤狀木霉（71. Asaza ?ω?)、綠色木霉（71. κ/riofe)、 枯草芽抱桿菌（a野ioJi識(shí)/e/acieft?)、解淀粉芽抱桿菌（漢a野ioJi識(shí)/e/acieft?) 和多粘芽孢桿菌（漢可以防治真菌病害。迄今為止有關(guān)木霉、芽孢桿菌在生 防方面的研究已開(kāi)展近70年，在國(guó)外已經(jīng)出現(xiàn)了商品化的木霉、芽孢桿菌制劑。如以防 治李屬果樹(shù)銀葉?。╥ereiM? /wr/wreiM?)的木霉制劑在西歐已商品化生產(chǎn)；以 色列的Makhteshim Agan公司開(kāi)發(fā)的以哈茨木霉T39菌株為發(fā)酵液的生防制劑，商品名 Trichodex，劑型為25%可濕粉，它可以用于防治灰霉病菌ciflerea)、菌核病菌 scJeiOiior·)、葉霉?。–/at/oSjOari· 等病害。21 世紀(jì)被稱為環(huán)保 世紀(jì)，化學(xué)藥劑的應(yīng)用逐步受到限制，因此對(duì)蔬菜病害的生物防治研究自然稱為熱點(diǎn)問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明正是基于以上原因，以目前蔬菜為害較為嚴(yán)重，又缺乏生物防治手段的的 茄果類蔬菜病毒病為靶標(biāo)，從微生物資源中尋找具有高效誘抗、鈍化病毒等活性的微生物， 擬為研究開(kāi)發(fā)新型生物菌劑尋找新的資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明旨在提供一種防控茄果類蔬菜病毒病的深綠木霉、解淀粉芽孢桿菌制劑及 其制備方法，可以用于防控茄果類蔬菜病毒病，解決化學(xué)農(nóng)藥防治帶來(lái)的農(nóng)藥殘留、抗藥性 和環(huán)境污染問(wèn)題。本發(fā)明具有高效、性能穩(wěn)定、可規(guī)?；a(chǎn)的微生物菌劑，可用于防控 TMV、CMV、TYLCV等茄果類蔬菜病毒病。為實(shí)現(xiàn)此目的，本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)內(nèi)容： 一株具有體外鈍化、抑制侵染和誘導(dǎo)抗性作用的深綠木霉菌株，其特征在于該菌株為 深綠木霉Trl208 ( airoKiriofe)，已于2012年11月15日保藏于中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo. 6828。保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū) 北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所。
[0007] -株具有體外鈍化、抑制侵染和誘導(dǎo)抗性作用的解淀粉芽孢桿菌菌株，其特征在 于該菌株為解淀粉芽抱桿菌B1126 a野ioJit/i/e/'aciefts1)，已于2012年11月15 日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo. 6827。保藏 地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所。
[0008] 本發(fā)明保藏的深綠木霉菌株Trl208 ( airoKiriofe)的生理、生化特 性如下： 木霉菌株Tr 1208在PDA平板上生長(zhǎng)迅速，菌落在3天內(nèi)覆蓋直徑90mm的平板，呈輻射 狀，表面疏松平坦；在培養(yǎng)的第3天明顯可見(jiàn)有孢子產(chǎn)生，最初為淡綠色，以后逐漸增多，呈 現(xiàn)深綠色，產(chǎn)孢叢束排列成同心的輪紋。顯微觀察培養(yǎng)的菌絲體無(wú)色、分枝繁復(fù)，由具有橫 隔的分枝菌絲構(gòu)成；產(chǎn)生的分生孢子無(wú)隔膜，呈球形，聚成頭狀排列，單生，細(xì)胞壁存在明顯 而微小的粗糙突起。
[0009] 本發(fā)明保藏的解淀粉芽孢桿菌B1126 (ifeciWiAs a野ioJi識(shí)/e/aciefts·)的生理、生 化特性如下： 解淀粉芽孢桿菌B1126菌體污白色，半透明，光滑濕潤(rùn)菌落，稍隆起，圓形齊整菌落；革 蘭氏染色菌體呈陽(yáng)性，為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀；接觸酶實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性；葡萄糖 陽(yáng)性；乳糖陽(yáng)性；蔗糖陽(yáng)性。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種深綠木霉和解淀粉芽孢桿菌菌劑，是以深綠木霉Trl208 和解淀粉芽孢桿菌B1126菌體為有效活性成分，一種深綠木霉菌劑，其特征在于它是由 保藏號(hào)為CGMCCNo. 6828的深綠木霉Tr 1208 ( a iroκ/riofe)和保藏號(hào)為 CGMCCNo. 6827的解淀粉芽抱桿菌B1126 a野ioJi識(shí)/e/aciefts·)的菌體和它的次 生代謝物為有效活性成分，配以農(nóng)業(yè)上可以接受的載體以及菌體保護(hù)劑組成；其中有效活 性成分為5X109cfu/g -SXK^cfu/g，菌體保護(hù)劑含量為0· 1~1% (w/w)。
[0011] 本發(fā)明優(yōu)選的，其特征在于它是由保藏號(hào)為CGMCCNo. 6828的深綠木霉Trl208 (airoKiriofe)和保藏號(hào)為 CGMCCNo. 6827 的解淀粉芽抱桿菌 aazjio)的菌體和它的次生代謝物為有效活性成分，配以農(nóng)業(yè)上可以接受的載 體以及菌體保護(hù)劑組成；其中有效活性成分為5X 109cfu/g ~2X lOlfu/g，菌體保護(hù)劑含 量為 0· 1~1% (w/w)。
[0012] 本發(fā)明所述的深綠木霉和解淀粉芽孢桿菌菌劑，其菌體為深綠木霉的分生孢子、 菌絲和厚垣孢子，解淀粉芽孢桿菌的菌體和芽孢，以及農(nóng)業(yè)上可接受載體的混合；農(nóng)業(yè)上可 接受的載體為：硅藻土、碳酸鈣、水、小麥粉、木屑、高嶺土、不飽和烴類一種或幾種的混合 物；所述的菌體保護(hù)劑為黃原膠、蔗糖、腐植酸鈉、黃腐酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈣、山梨酸鉀一 種或幾種的混合物。
[0013] 本發(fā)明更加優(yōu)選的深綠木霉和解淀粉芽孢桿菌菌劑，其特征在于它是由下述成分 組成： 深綠木霉Trl208和解淀粉芽孢桿菌B1126含菌量為5X 109cfu/g ~2X 101Qcfu/g ; 黃原膠 〇· 02~0· 1% (w/w); 鹿糖 0· 05~0· 5% (w/w); 腐植酸鈉或黃腐酸鉀〇. 〇2~0. 2% (w/w); 苯甲酸鈉或丙酸鈣或山梨酸鉀〇. 〇l~〇. 2% (w/w)。
[0014] 余下量為碳酸鈣和硅藻土或水載體，其中碳酸鈣：硅藻土的重量份數(shù)比為1:2~5。
[0015] 本發(fā)明更進(jìn)一步公開(kāi)了深綠木霉和解淀粉芽孢桿菌菌劑的制備方法，其特征在于 按如下的步驟進(jìn)行： 1)菌種活化和菌液制備：保藏號(hào)為CGMCCNo. 6828的深綠木霉Trl208 ( rricAoi/eiwa aiiwinVe)的菌株，在23~28°C下，在馬PDA培養(yǎng)基中活化72h，備用；在23~28°C下，在Η) 培養(yǎng)液中震蕩培養(yǎng)72~96h，培養(yǎng)后得到深綠木霉Trl208種子液； 保藏號(hào)為CGMCCNo.6827的解淀粉芽抱桿菌B1126 a野ioJi識(shí)/e/aciefts·) 的菌株，30~37°C下，在ΝΑ培養(yǎng)基中活化24h，備用；在30~37°C下，在ΝΑ培養(yǎng)液中震蕩培養(yǎng) 24~48h，培養(yǎng)后得到解淀粉芽孢桿菌Β1126菌液； 所述的PDA培養(yǎng)基(或培養(yǎng)液）組成為：馬鈴薯300克、葡萄糖20克、瓊脂15~20克 (培養(yǎng)液不添加)、蒸餾水1000毫升，自然pH ; 所述的ΝΑ培養(yǎng)基(或ΝΑ培養(yǎng)液）組成為：牛肉浸膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖2. 5g、15~20 克(培養(yǎng)液不添加)、蒸餾水1000毫升，pH7±0. 5 ; 3)固體發(fā)酵培養(yǎng)及菌粉的獲得：在固體發(fā)酵培養(yǎng)基料中加入水20~45% (w/w)，初始pH 為6. 5~7. 5之間，高溫滅菌，然后待溫度降到30°C以下，接入步驟2)的深綠木霉Trl208種 子液，再在溫度為20~30°C，間隔24~30h，定期攪拌的條件下發(fā)酵培養(yǎng)96~148h ;測(cè)定發(fā)酵培 養(yǎng)基料中菌體的數(shù)量，待發(fā)酵基料中孢子量達(dá)到109 cfu/g以上后停止發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)物料 經(jīng)常溫干燥，采用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎、過(guò)篩后成深綠木霉菌粉； 所述的固體發(fā)酵培養(yǎng)基料（w/w)的組成為：麥粉2~4%，麥麩12~18%，食用菌廢料渣或/ 和木屑77. 1~84%，過(guò)磷酸鈣0. 5~1%，尿素0. 2~0. 5%，蔗糖0. 2~0. 5%，潤(rùn)水后滅菌備用； 解淀粉芽孢桿菌B1126菌液經(jīng)過(guò)噴霧干燥，獲得解淀粉芽孢桿菌菌粉。
[0016] 4)制備深綠木霉和解淀粉芽孢桿菌菌劑：深綠木霉Trl208和解淀粉芽孢桿 菌B1126菌粉；黃原膠0. 02~0. 1% (w/w);蔗糖0. 05~0. 5% (w/w);腐植酸鈉或黃腐酸鉀 0. 02~0. 2% (w/w);苯甲酸鈉或丙酸鈣或山梨酸鉀0. 01~0. 2% (w/w)。余下量為碳酸鈣和硅 藻土或水載體，其中碳酸鈣：硅藻土的重量份數(shù)比為1:2~5?；旌现苽渖罹G木霉和解淀粉芽 孢桿菌菌劑含菌量5X 109cfu/g ~2X K^cfu/g。
[0017] 本發(fā)明同時(shí)也公開(kāi)了深綠木霉Tr 1208和解淀粉芽孢桿菌B1126菌株制備作為防 控茄果類蔬菜病毒病菌劑中的應(yīng)