(尤其在其邊緣)為淡淡的粉紅色，隨即轉(zhuǎn)為灰色，再由灰色轉(zhuǎn)為褐色， 最后由褐色轉(zhuǎn)為黑褐色，菌落也成為碳質(zhì)，培養(yǎng)皿背面呈黑褐色放射條紋狀，分生孢子團(tuán)桔 黃色。在寄主上，病原菌分生孢子盤生于寄主表皮下，分散或合生，成熟后突破表皮露出，不 規(guī)則開裂，散生剛毛，剛毛褐色至暗褐色，具1-3個隔膜，直或微彎，向頂端漸尖且色淡;分生 孢子梗無色，產(chǎn)孢細(xì)胞圓柱形，無色，分生孢子單胞，無色，長圓形或橢圓形，一端稍尖，（14 ~15)μπιΧ(4.5~6)μπι，有時含油球。菌絲或芽管頂端接觸固體界面時產(chǎn)生附著胞，附著胞 褐色，長棍棒形或呈不規(guī)則形，（9~10)μηιΧ (5~6)μηι。
[0051 ] 2.5病原菌鑒定
[0052] 根據(jù)對鐵皮石斛褐斑病的病原菌分離物的形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)性狀和致病性測定的 研究結(jié)果(具體實(shí)驗數(shù)據(jù)略），參閱專著（張忠義等，1986;陸家云，2001)及吳文平（1991)對 漆斑菌屬4個種的研究；確定鐵皮石斛褐斑病是由半知菌亞門（Deuteromycotina)、球殼孢 目（Sphaeropsidales)、球殼抱科（Sphaerioidaceae)、莖點(diǎn)霉屬（Phoma)、多卩彖莖點(diǎn)霉 (Phoma multirostrata(Mathuretal · )Dorenboseh&Boerema)弓丨起的。
[0053] 2.6不同培養(yǎng)基對石斛褐斑病菌菌絲生長的影響(具體結(jié)構(gòu)見表2)
[0054]石斛褐斑病菌在PSA培養(yǎng)基、0ΜΑ培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、石斛煎汁培養(yǎng)基、樹皮煎汁 培養(yǎng)基、甘薯煎汁培養(yǎng)基、草莓煎汁培養(yǎng)基、荷葉煎汁培養(yǎng)基等8種不同培養(yǎng)基上(表1)，于 25 °C恒溫下生長。測定結(jié)果表明該菌在所試驗的培養(yǎng)基上均能生長，其中石斛褐斑病菌在 甘薯煎汁培養(yǎng)基、荷葉煎汁培養(yǎng)基，0ΜΑ培養(yǎng)基，草莓煎汁培養(yǎng)基上生長最快，生長速度(邏 輯斯蒂增長率)最高可達(dá)8.013、7.553、7.594,7.956。但該菌落在甘薯煎汁培養(yǎng)基和荷葉煎 汁培養(yǎng)基上生長較稀薄，生物量干重明顯比PSA培養(yǎng)基小，綜合生長速度與生長量，該菌較 適宜生長的培養(yǎng)基為PSA培養(yǎng)基、OMA培養(yǎng)基，樹皮煎汁培養(yǎng)基，草莓煎汁培養(yǎng)基。
[0055] 該菌在所試驗的培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生黑色的分生孢子器，其中以草莓煎汁培養(yǎng)基產(chǎn) 生的分生孢子器數(shù)量最多，數(shù)量可達(dá)0.85X 104個/mL，與其他處理達(dá)到極顯著差異(具體分 析過程略），其次為PSA、0ΜΑ培養(yǎng)基和樹皮煎汁培養(yǎng)基(與其他處理達(dá)到顯著差異）。因此0ΜΑ 培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基和草莓煎汁培養(yǎng)基為最適產(chǎn)孢培養(yǎng)基。因為產(chǎn)黑色的分生孢子器是有效 繁殖該病原菌的一個最有效的途徑，利于這些孢子的生長可以進(jìn)行超級傳染病菌和超級抗 藥性病菌的篩選，對于防治該病進(jìn)行基礎(chǔ)研究最有益處。
[0056] 表2不同培養(yǎng)基對石斛褐斑病菌菌絲生長和分生孢子形成的影響
[0057]
[0059] 注:r(t = 7d)為菌落面積日均增長率，r(l〇git)為菌落面積的邏輯斯蒂值日均增 長率;t(s = 50%)為根據(jù)r(logit)值估算出的菌落生長至皿面積一半所需時間（d);培養(yǎng)溫 度 25°C。
[0060] 對于本發(fā)明的部分?jǐn)?shù)據(jù)都進(jìn)行了方差分析，各個處理之間的分析接哦股都標(biāo)示在 相應(yīng)的處理上，其中，當(dāng)各個上標(biāo)的字母不相同的時候(單個字母），表示他們之間存在顯著 差異，如果上標(biāo)的字母為2個或兩個以上，表示他們之間沒有差異，但是單個字母的處理與2 個字母的處理之間存在顯著差異。本領(lǐng)域的一般人員看到這樣的表示方法后容易明白他們 的關(guān)系。
[0061] 2.7pH值對石斛褐斑病菌菌絲生長和分生孢子形成的影響(表3)
[0062]經(jīng)測定石斛褐斑病菌在pH值3~12范圍內(nèi)均能生長，pH為5.0~11.0時菌落擴(kuò)展速 度較快，其菌落直徑邏輯斯蒂增長率分別達(dá)0.391~0.502，其中以pH值為7.0生長最快，其 菌落直徑邏輯斯蒂增長率達(dá)0.587(表3)。病菌在pH值6.0~8.0時，可產(chǎn)生較多的分生孢子， 其中以pH值為7.0產(chǎn)生分生孢子量最多，每皿的分生孢子數(shù)達(dá)0.90 X 104。菌落生長的干重 在pH值為3.0~12.0之間均為中等厚薄。說明該菌菌絲生長和產(chǎn)生分生孢子的最適pH值為 7.0,該菌喜歡中性的生長環(huán)境。
[0063] 表3不同pH值對石斛褐斑病菌菌絲生長和分生孢子形成的影響
[0064]
[0065]
[0066] 注:r(t = 7d)為菌落面積日均增長率，r(l〇git)為菌落面積的邏輯斯蒂值日均增 長率;t(s = 50%)為根據(jù)r(logit)值估算出的菌落生長至皿面積一半所需時間（d);培養(yǎng)溫 度 25°C。
[0067] 2.8溫度對石斛褐斑病菌菌絲生長和分生孢子形成的影響(表4)
[0068] 經(jīng)測定石斛褐斑病菌在10°C~35°C范圍內(nèi)均能生長，其中以15°C~30°C生長較為 適宜，10°C以下或35°C以上，生長幾乎停止。其中以25°C~30°C為最適，其菌落直徑邏輯斯 蒂增長率達(dá)0.81~0.84(表4)。在20°C~35°C均能形成的分生孢子，以25°C~30°C以形成的 分生孢子量最多，每皿的生孢子數(shù)達(dá)0.85 X 104~0.89X 104。在10°C~35°C范圍內(nèi)菌落干重 中等以上，在20 °C~30 °C時菌落干重為厚。因此，石斛褐斑病菌在25 °C~30 °C范圍內(nèi)最適宜 生長。
[0069] 表4不同溫度對石斛褐斑病菌菌絲生長和分生孢子形成的影響
[0070]

[0071] 注:r(t = 7d)為菌落面積日均增長率，r(l〇git)為菌落面積的邏輯斯蒂值日均增 長率;t(s = 50%)為根據(jù)r(logit)值估算出的菌落生長至皿面積一半所需時間（d);培養(yǎng)溫 度 25°C。
[0072] 2.9碳源對石斛褐斑病菌菌絲生長和分生孢子形成的影響
[0073]對20種碳源測定顯示，石斛褐斑病菌在除DEAE纖維素外的其他碳源培養(yǎng)基上均能 生長。生長速度快的有麥芽糖、蔗糖、菊糖、核糖、果糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇、纖維乙糖等8 種，但有部分菌落生長稀薄，結(jié)合菌落營養(yǎng)生長的干重，較適宜的培養(yǎng)基為蔗糖、甘露糖、核 糖、果糖、乳糖、葡萄糖、纖維乙糖。
[0074]培養(yǎng)10天后，該菌在除DEAE纖維素外的19種碳源培養(yǎng)基上均能產(chǎn)生黑色的分生孢 子器，根據(jù)分生孢子器產(chǎn)量，分生孢子器產(chǎn)量大的培養(yǎng)基有纖維乙糖、蔗糖、可溶淀粉、麥芽 糖、乳糖、葡萄糖、鼠李糖等7種，其產(chǎn)孢量在1.19 X 104~2.15 X 104。特別是纖維乙糖的產(chǎn)孢 數(shù)量顯著超過了蔗糖。
[0075]綜上所述，最適宜該菌生長的碳源為是蔗糖、可溶淀粉、麥芽糖、纖維乙糖、乳糖、 葡萄糖、鼠李糖、山梨醇、果糖、菊糖等10種。其中當(dāng)碳源為纖維乙糖時該菌能產(chǎn)生更多的分 生孢子，最適宜繁殖。
[0076]表5不同碳源對石斛褐斑病菌菌絲生長和分生孢子形成的影響
[0077]
[0078] 注:r(t = 7d)為菌落面積日均增長率，r(l〇git)為菌落面積的邏輯斯蒂值日均增 長率;t(s = 50%)為根據(jù)r(logit)值估算出的菌落生長至皿面積一半所需時間（d);培養(yǎng)溫 度 25°C。
[0079] 2.10氮源對石斛褐斑病菌菌絲生長和分生孢子形成的影響
[0080] 經(jīng)27種有機(jī)氮和無機(jī)氮對石斛褐斑病菌菌絲生長及分生孢子形成的測定表明：該 菌均能利用有機(jī)氮和無機(jī)氮生長及繁殖，其中以L-脯氨酸、L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨 酸、硝酸鉀較適宜菌絲生長，其菌落直徑邏輯斯蒂增長率達(dá)0.545~0.616(表6)。該菌在各 種氮源上均能形成分生孢子，其中L-脯氨酸、L-絲氨酸、亞硝酸鈉、酪蛋白水解物等適于分 生孢子的產(chǎn)生，每皿的生孢子數(shù)達(dá)0.70 X 104~0.86 X 104。平均干重在0.65g以上。綜合病原 菌的營養(yǎng)生長和繁殖生長，因此，L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-色氨酸是適宜該菌的氮源。
[0081 ]表6不同氮源對石斛褐斑病菌菌絲生長和分生孢子形成的影響
[0082]
[0084]注:r(t = 7d)為菌落面積日均增長率，r(l〇git)為菌落面積的邏輯斯蒂值日均增 長率;t(s = 50%)為根據(jù)r(logit)值估算出的菌落生長至皿面積一半所需時間（d);培養(yǎng)溫 度 25°C。
【主權(quán)項】
1. 一種鐵皮石斛褐斑病菌的培養(yǎng)方法，該方法包括:提供草莓煎汁培養(yǎng)基，其中該草莓 煎汁培養(yǎng)基的組成為:草莓莖葉200g，蔗糖20g，瓊脂20g，添加水至1000ml。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，草莓煎汁培養(yǎng)基的制備方法為：在煎鍋中放入 1000mL蒸餾水和200g草莓莖葉，煮沸5min后，過濾去除莖葉，加入20g蔗糖，瓊脂20g，定容至 1000mL〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，培養(yǎng)的PH值為7。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，培養(yǎng)的溫度為25-30攝氏度。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述的鐵皮石斛褐斑病菌為多喙莖點(diǎn)霉。6. -種草莓煎汁培養(yǎng)基在制作培養(yǎng)鐵皮石斛褐斑病菌培養(yǎng)基中的用途，其中所述的草 莓煎汁培養(yǎng)基由下列組分組成:草莓莖葉200g，蔗糖20g，瓊脂20g。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中，草莓煎汁培養(yǎng)基的制備方法為：在煎鍋中放入 1000mL蒸餾水和200g草莓莖葉，煮沸5min，過濾去除莖葉，加入20g蔗糖和瓊脂20g，定容至 lOOOmLo8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中，所述的草莓煎汁培養(yǎng)基的PH值為7。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種鐵皮石斛褐斑病菌的培養(yǎng)方法，該方法包括：提供草莓煎汁培養(yǎng)基，其中該草莓煎汁培養(yǎng)基的組成為：草莓莖葉200g，蔗糖20g，瓊脂20g，添加水至1000ml。使用本發(fā)明的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法可以大量獲得該病菌的孢子。
【IPC分類】C12R1/645, C12N1/14
【公開號】CN105567569
【申請?zhí)枴緾N201510918364
【發(fā)明人】王漢榮, 王連平, 方麗
【申請人】浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月11日