一株耐高溫園林廢棄物分解菌st2及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境生物技術領域，具體涉及從園林廢棄物堆肥中篩選出的一株高效降解纖維素的耐熱菌及其在園林廢棄物高溫堆肥中的應用。
【背景技術】
[0002]園林廢棄物指園林植物自然凋落或人工修剪所產生的枯枝、落葉、草肩、殘花、樹木與灌木剪枝及其它植物殘體等，主要成分為難降解的纖維素和半纖維素。近年來，我國園林廢棄物每年8%_10%的速度遞增，給城市綠色化進程帶來了巨大阻力，目前我國處理園林廢棄物的方式主要為焚燒和填滿，這兩種處理方式不僅浪費了可再生資源還造成了嚴重的環(huán)境污染。因此，如何合理有效處理園林廢棄物，使其資源化利用是目前大家普遍關注的熱點問題之一。
[0003]利用堆肥技術將園林廢棄物腐熟制成有機肥料和育苗基質等，是其資源化利用的有效出路之一，然而園林廢棄物中含有大量的木質素、纖維素等難降解的物質，導致堆肥效率低、周期長，大大限制了園林廢棄物的再利用價值。因此需要向堆肥中加入特定的微生物，以加快園林廢棄物腐熟過程。纖維素降解菌是一類能夠產生胞外纖維素酶將纖維素大分子水解成葡萄糖的微生物，可以加速纖維素材料的降解速度。自然界中，產生纖維素的微生物種類很多，目前研究和應用得較多的是真菌，如木霉、青霉屬、曲霉屬、根霉屬等。細菌和放線菌的研究和應用均較少。堆肥過程中纖維素降解主要發(fā)生在高溫期，而真菌主要在中溫條件下，酶活最大，隨著堆肥過程溫度的上升，真菌活菌數(shù)量及其產生的酶活性大大降低，這就限制了產纖維素酶霉菌的在堆肥中的利用。耐高溫纖維素降解菌的篩選和應用是解決上述問題的有效措施。
[0004]很多纖維素降解菌都是針對玉米秸桿、稻草、麥秸等農業(yè)廢棄物，很少有專門針對園林廢棄物纖維素材料的降解菌的篩選和利用研究。中國專利“一株高溫纖維素降解菌及其應用”(專利申請?zhí)?201410018582.6)公布了一株從園林廢棄物高溫期堆肥樣品中分離的高溫纖維素降解菌地芽孢桿菌，纖維素酶活性為7.8 U/ml，該菌為細菌。關于從園林廢棄物堆肥中分離耐高溫纖維素降解放線菌的報道較少。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術問題是:提供一株耐高溫嗜熱淀粉酶鏈霉菌，該菌能在40-70°C高溫內大量產酶，纖維素酶活性高，具有耐高溫、高效降解纖維素特性，可將其作為微生物菌劑應用于高溫堆肥體系中，適用于園林廢棄物堆肥。
[0006]本發(fā)明提供的技術方案是:一株耐高溫纖維素降解菌嗜熱淀粉酶鏈霉菌(Streptomyces thermodiastaticus)ST2，保藏編號為CGMCC N0.12134，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0007]本發(fā)明所述嗜熱淀粉酶鏈霉菌(Streptomyces1:1161'1]10(1丨&8七&1:;[(3118)312已于2016年2月18日為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，郵政編碼:100101)，其保藏號為CGMCC N0.12134，經檢測存活。
[0008]本發(fā)明嗜熱淀粉酶鏈霉菌(Streptomyces thermodiastaticus)ST2，是從北京昌平區(qū)某蘋果園園林廢棄物堆肥高溫中期采集的樣品中分離的菌種，將其編號為菌株ST2，該菌能夠在40-70°C條件下產生纖維素酶并降解纖維素。菌株在高氏I號培養(yǎng)基上生長時，氣生菌絲為淺灰色，菌絲多分支，基內菌絲灰黃色，不產生可溶性色素，氣生菌絲分支，在氣生菌絲上生有孢子絲。顯微鏡下，菌體呈菌絲狀，革蘭氏染色呈陽性，孢子卵圓形，表面光滑，孢子絲略彎曲，呈螺旋狀。結合菌落菌體形態(tài)特征和基于細菌16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，將其鑒定為嗜熱淀粉酶鏈霉菌(Streptomyces thermodiastaticus)。
[0009]本發(fā)明所述菌株生產纖維素酶的方法，將該菌接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分:CMC-Na 0.5%，蛋白胨 1%，麩皮 3%, NaCl 2%, KH2PO4 0.l%g,MgS04.7H20 0.02%, (NH4)2SO40.3%，pH 7.0-7.6)中，于溫度50°C、rpml50轉搖床中培養(yǎng)3_4d，離心取上清液，測定纖維素酶活性。
[0010]本發(fā)明還提供一種適用于園林廢棄物為主要堆肥材料的高溫堆肥腐熟劑，該腐熟劑以液體發(fā)酵方式獲得，菌液濃度為5 X 19 CFU/mL，麩皮和玉米面2:1混合作為菌液吸附劑，按菌液與吸附劑1:1混合，制作成固態(tài)菌劑。
[0011]同時，本發(fā)明還提供所述嗜熱淀粉酶鏈霉菌ST2菌株在以園林廢棄物為主要材料的堆肥腐熟中的應用，以園林廢棄物為主要堆肥原料，添加動物糞便和水，使混合物料碳氮比為25-40:1、含水率50-60%，固態(tài)腐熟劑按物料重量的5%比例接種到堆肥物料中，進行高溫堆肥。
[0012]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明所述嗜熱淀粉酶鏈霉菌(Streptomyces thermodiastaticus) ST2是從園林廢棄物堆肥中篩選出降解纖維素的菌種，可在40-70°C溫度范圍內產生較多的纖維素酶，酶活高達63.55 U/mL，具有耐高溫、高效降解纖維素特性。相對真菌在中溫條件下酶活最大，而細菌產酶活力較低的問題，嗜熱淀粉酶鏈霉菌既能適應高溫環(huán)境，又能產生較高的纖維素酶，對纖維素材料具有很好的降解能力，所以嗜熱淀粉酶鏈霉菌更能適應堆肥過程復雜環(huán)境。
[0013]將本發(fā)明獲得的耐高溫纖維素降解菌制成固態(tài)腐熟劑添加到以園林廢棄物為主要材料的堆肥中，與不接種的對照相比，能夠提高堆肥進入高溫期的時間、延長高溫期持續(xù)時間已經高溫期溫度，降低堆肥C/N比，從而加快堆肥腐熟進程?？蓪⑵渥鳛槲⑸锞鷦糜诟邷囟逊鼠w系中，適用于園林廢棄物堆肥。
[0014]本發(fā)明是針對園林廢棄物堆肥材料篩選的菌種和制備的腐熟劑，可以為園林廢棄物的資源化利用提供一條合理、有效的途徑，實現(xiàn)降低環(huán)境污染、資源循環(huán)利用的目的。
【附圖說明】
[0015]圖1嗜熱淀粉酶鏈霉菌(Streptomyces thermodiastaticus)分離純化圖片
圖2本發(fā)明嗜熱淀粉酶鏈霉菌(Streptomyces thermodiastaticus)的16S rDNA基因序列。
[0016]圖3通過嗜熱淀粉酶鏈霉菌(Streptomyces thermodiastaticus)和相近菌株16SrDNA的基因序列進行同源性Blast比對時構建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖片。
[0017]圖4堆肥過程中堆體溫度變化。
[0018]圖5堆肥過程中碳氮比(C/N比)變化。
【具體實施方式】
[0019]下面通過【具體實施方式】的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。
[0020]實施例1耐高溫纖維素降解菌株篩選
從北京昌平區(qū)某蘋果園園林廢棄物堆肥高溫初期、高溫中期、高溫后期材料、北京延慶平原造林地區(qū)園林綠化廢棄物堆積物中采集樣品；稱取上述新鮮樣品1g放于裝有10粒玻璃珠、并盛有90 ml無菌水的錐形瓶中，置于30°C 150 rpm的搖床中搖30 min，使樣品充分散開，50°C下靜置富集培養(yǎng)24h。用無菌吸管吸取I ml上清液加入到含有9ml無菌水的試管中，此即為10—1樣品稀釋液，再從10—1樣品中取Iml加入到9ml無菌水中，此即為10—2樣品稀釋液，以此類推，得到10—3、10—4、10—5、10—6樣品稀釋液，然后用移液器吸取100 μ?的10—3、10—4、10—5、10—6樣品稀釋液于纖維素剛果紅培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基組成為:K2HPO4 0.5g，微晶纖維素1.88g，MgS04 0.25g，明膠2.0g，剛果紅0.5g，瓊脂16g，蒸饋水1000ml，pH
7.0)，用涂布器把稀釋液均勻涂布于整個平板，并置于50°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。挑選在纖維素剛果紅平板上有明顯透明圈的菌落，進行編號，再進行反復劃線分離純化獲得純種菌株，將分離后的菌種接到斜面上，4°C保存進行后續(xù)實驗。
[0021]將保藏于4°C的純菌株轉接到羧甲基纖維素培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分=CMC-Na 15.0g，NH4NO3 l.0g，酵母膏 1.0g，MgS04.7H20 0.5g, KH2PO4 l.0g，蒸餾水 1000ml，瓊脂 16g，pH
7.0)平板上，50°C下活化培養(yǎng)，然后挑起平板上的單菌落轉接到纖維素剛果紅平板上，置于50 0C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后測量菌落直徑d和透明圈直徑D