測量菌落直徑d和透明圈直徑D，計算其比值H，即H=D/d，H值越大，值較大表示該菌株分解纖維素的能力越強。按照纖維素剛果紅鑒定培養(yǎng)基上形成透明圈的大小初步確定其產纖維素酶活性。
[0022]通過上述操作，獲得多株纖維素降解菌，其中在北京昌平區(qū)某蘋果園園林廢棄物堆肥高溫中期采集的樣品中分離的菌種，命名為ST5的，于2016年2月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC (單位地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼:100101)，保藏編號為CGMCCN0.12137。對ST5菌株進行光學顯微觀察和革蘭氏染色鑒定，該菌在高氏I號培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，氣生菌絲灰色，基內菌絲深褐色，不產生可溶性色素。顯微鏡下，菌體呈菌絲狀，革蘭氏染色呈陽性，孢子卵圓形，表面光滑，孢子絲螺旋狀，柔曲，見圖1。
[0023]實施例2ST5菌株分子生物學鑒定
對篩選得到的熱普通鏈霉菌ST5進行分子鑒定，按照以下步驟進行:挑取篩選菌株的單菌落接種于液體高氏I號培養(yǎng)基中，30°C、120r/min搖床振蕩培養(yǎng)，在第2d取出培養(yǎng)液，5000r/min離心Imin取上清液，按照細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司提供)，提取菌落DNA;通用引物27F和1492R對提取的細菌DNA進行PCR擴增；27F序列為5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-37 ; 1492R序列為5'-AAG GAG GTG ATC CAG CCGCA-3、將PCR產物進行序列測序，測序結果在NCBI數據庫中BLAST進行序列分析，并進行同源性比較。
[0024]波茨坦短芽孢桿菌的16S rDNA基因序列(請參見圖2)長度為1418bp，將基因序列提交到Genbank上，進行同源性比較，然后采用MEGA 6.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3，從而確定菌株的種屬。結果表明該序列與熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)的16S rDNA基因序列相似度高達100%，同時結合菌落形態(tài)特征、生理生化特征、菌體顯微特征確定ST5菌株為熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)。
[0025]實施例3熱普通鏈霉菌ST5生長測定
將熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris) ST5接種到CMC液體培養(yǎng)基中(CMC-Na 15.0g,NH4NO3 l.0g，酵母膏 1.0g,MgSO4 0.5g,KH2PO4 l.0g，蒸餾水 100mL)，每隔2h取培養(yǎng)液，聯續(xù)取樣到48h，測定各時期的0D600值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，各取樣點的0D600值為縱坐標，繪制該菌的生長曲線，即該菌的生長測定。從測定結果可以看出O-Sh為延遲期、9-16h為對數生長期、16?24h為穩(wěn)定期、>26h為衰亡期。對數期的菌株的生長迅速、活力強，因此以后的發(fā)酵產酶實驗中，應選用12小時的發(fā)酵液為種子液進行接種。
[0026]實施例4熱普通鏈霉菌ST5產纖維素酶活力測定
將對數期熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris) ST5按1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分:CMC-Na 0.5%，蛋白胨 1%，麩皮 3%,NaCl 2%,KH2PO4 0.1%,MgSO4-7H20 0.02%, (NH4)2SO4 0.3%), pH 7.0-7.6)中，于溫度 50°C、rpml50 轉搖床中培養(yǎng) 3_4d，將培養(yǎng)物8000r/min離心5min，取上清即為粗酶液，用DNS法測定纖維素酶活。取I mL上清液于試管中(空白用I ml蒸餾水代替)，置于50°C水浴鍋中，預熱2min，然后加入4 ml已經在50°C預熱的底物溶液，計時反應5min后取出，加入4mL DNS顯色液，搖勻后放置于沸水浴中加熱5 min，取出后立即放入冷水浴中冷卻，用蒸餾水定容至20ml，混勻后在540nm波長處測定吸光度。對照標準曲線后換算該菌株的產酶活力。酶活力單位按照國際單位規(guī)定定義，即在I mL體系中，在I min內催化纖維素水解生成I μπιο?葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位(U/mL)。經測定ST5菌株的纖維素酶活性為28.02 U/mL。
[0027]實施例5固態(tài)腐熟劑的制備
(I)菌株活化:取本發(fā)明微生物4°C保存斜面接種至高氏I號固體平板培養(yǎng)基，在500C的恒箱中培養(yǎng)12h實現菌株活化。
[0028](2)種子液制備:將步驟(I)中經斜面活化的菌種平板I個接種至I L無菌高氏I號液體培養(yǎng)基中，50°C 150rpm搖床條件下培養(yǎng)12h后得種子液。
[0029](3)發(fā)酵種子液的制備:上述種子液按6-10%(v/v)的接種量接種至已滅菌的發(fā)酵罐中，進行擴大發(fā)酵培養(yǎng)。在溫度50°C、振蕩頻率120 rpm的條件下，培養(yǎng)48h后得發(fā)酵種子液。
[0030](4)固態(tài)腐熟劑的制備:將麥麩與玉米面按照2:1質量比混合后作為菌液吸附劑，與步驟(3)中制得的菌液，按菌液與吸附劑體積質量比1:1混合，制作成固態(tài)腐熟劑，堆置I周后，可用于高溫堆肥。
[0031]實施例6腐熟劑的堆肥效果試驗
以園林廢棄物為主要堆肥原料，添加動物糞便和水，使混合物料碳氮比為25-40:1、含水率50-60%，固態(tài)腐熟劑按物料重量的5%比例接種到堆肥物料中，進行高溫堆肥，以不加腐熟劑的材料為對照，當堆體溫度上升到50°C時，開始翻堆，高溫期每2天翻堆一次，降溫期每周翻堆一次，當溫度下降到40°C后不在翻堆。堆肥過程中，通過測定堆體每天的溫度變化、堆肥材料碳氮(C/N)比變化，考察添加腐熟劑對園林廢棄物堆肥腐熟進度的影響。
[0032]堆肥過程中堆體溫度變化如圖4所示。由圖4可知，接種腐熟劑的堆肥處理在堆肥第3d溫度上升到50°C以上，而且50°C以上的高溫期持續(xù)24d，之后溫度開始下降。而未接種的堆肥處理溫度在堆肥第4d才上升到50°C以上，比接種的處理推遲Id到達50°C以上高溫期，而且50°C以上高溫期持續(xù)時間是17d，比接種的處理少了7d，接種處理的堆體高溫期的最高溫度也高于未接種處理，說明接種腐熟劑后能夠加快堆肥進入高溫期時間，以及高溫期持續(xù)時間。堆肥過程中C/N變化如圖5所示。由圖5可知，隨著堆肥的進行，接種腐熟劑和不接種的處理C/N比均持續(xù)降低，而接種的處理下降程度高于未接種處理，由此說明，添加本菌制得的腐熟劑可以加快堆肥進程，提高園林廢棄物堆肥的腐熟效果。
【主權項】
1.一株耐高溫纖維素降解菌熱普通鏈霉菌(Streptomycesthermovulgaris)，保藏號為CGMCC N0.12137。2.一種適用于園林廢棄物為主要堆肥材料的高溫堆肥腐熟劑，其特征在于:該腐熟劑以液體發(fā)酵方式獲得，其原料為菌液及吸附劑，按菌液與吸附劑按比例混合，制作成固態(tài)菌劑，其中菌液為權利要求1所述的熱普通鏈霉菌(Streptomyces thermovulgaris)菌液，吸附劑為麩皮和玉米面。3.如權利要求2所述的高溫堆肥腐熟劑，其特征在于:所述菌液濃度為5X 19 CFU/mL，麩皮和玉米面2:1混合作為菌液吸附劑，按菌液與吸附劑1:1混合，制作成固態(tài)菌劑。4.如權利要求2或3所述高溫堆肥腐熟劑在堆肥腐熟中的應用。5.如權利要求4所述的應用，其特征在于:以園林廢棄物為主要堆肥原料，添加動物糞便和水，使混合物料碳氮比為25-40:1、含水率50-60%，固態(tài)腐熟劑按物料重量的2.5%_5%比例接種到堆肥物料中，進行高溫堆肥。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株耐高溫纖維素降解菌熱普通鏈霉菌(<i>Streptomyces</i><i>？thermovulgaris</i>)，保藏號為CGMCC？No.12137。本發(fā)明所述菌能在40-70℃高溫內大量產酶，纖維素酶活性高，具有耐高溫、高效降解纖維素特性，可將其作為微生物菌劑應用于高溫堆肥體系中，適用于園林廢棄物堆肥。CGMCC No. 1213720160218
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/465, C05F11/08
【公開號】CN105567610
【申請?zhí)枴緾N201610119799
【發(fā)明人】周金星, 連鵬, 彭霞薇, 鄭景明
【申請人】北京林業(yè)大學
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年3月3日