一種過氧化氫酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明公開了一種過氧化氫酶的制備方法，屬于過氧化氫制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]過氧化氫酶，又稱觸酶，是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，是以過氧化氫為底物，通過催化一對電子的轉(zhuǎn)移而最終將其分解為水和氧氣，其系統(tǒng)名稱是H2O2 = H2O2氧化還原酶，國際酶學(xué)委員會的編號為ECl.11.1.6。過氧化氫酶分子結(jié)構(gòu)中含有鐵卟啉環(huán)，I個分子酶蛋白中含有4個鐵原子，其作用基團是血紅素。過氧化氫酶主要由四種次單元組成，每一種單元含一種蘇木精衍生物稱為ProtohemelX。不管什么來源，它的分子量均是225。過氧化氫酶是在生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，其生物學(xué)功能是催化細胞內(nèi)過氧化氫分解，防止脫脂過氧化。目前過氧化氫酶主要的應(yīng)用領(lǐng)域包括:臨床、醫(yī)藥及食品加工等領(lǐng)域。
[0003]在食品工業(yè)中，過氧化氫酶能迅速有效地分解食品加工后殘留過氧化氫(雙氧水)，適用于在食品加工過程中使用過氧化氫(雙氧水)作為漂白劑、氧化劑、淀粉變性劑、防腐劑的食品除氧，可用于紙塑無菌包裝材料殺菌后在包裝之前的除氧；以及用于消除牛奶、蛋制品、干酪等生產(chǎn)中因紫外線照射產(chǎn)生過氧化氫而造成的特異臭味，是一種用于食品加工的新型除氧酶;產(chǎn)品也可用作烘焙食品的膨松劑;具有保護食品營養(yǎng)物質(zhì)不被過氧化氫破壞，避免因過氧化氫隨食品進入人體內(nèi)造成對人體傷害的作用。
[0004]酶的純化工作非常復(fù)雜，除了要保證純度外，酶產(chǎn)品還必須保持其生物活性。純化工藝必須能夠每次都能產(chǎn)生相同數(shù)量和質(zhì)量的酶，重復(fù)性良好。這就要求應(yīng)用適應(yīng)性非常強的方法而不是用能得到純酶的最好方法去純化酶。在實驗室條件下的好方法卻可能在大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中失敗，因為后者要求規(guī)模化，且在每日的應(yīng)用中要有很好的重復(fù)性。
[0005]目前，國內(nèi)外主要是從豬、牛等動物肝臟中提取純化而得，如CN1436846提出了一種由動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法，該方法經(jīng)過將動物肝臟在酸性條件下粗提、高速離心、硫酸銨沉淀、熱變性等四個步驟最后得到過氧化氫酶溶液，但是該方法中要用到大量的飽和度45 %的硫酸銨，在生產(chǎn)中容易造成大量無機鹽的污染，不是環(huán)境友好型生產(chǎn)工藝，而且該方法得到的酶的活性不是很高，并只得到酶溶液而不是干品。
[0006]因此，通過改進傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，最終得到產(chǎn)物得率高、酶活性穩(wěn)定，且生產(chǎn)周期短、純度高的食品級過氧化氫酶產(chǎn)品是很重要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題:針對目前傳統(tǒng)方法在提取過氧化氫酶的過程中，大多數(shù)都是要用到大量的飽和度45%的硫酸銨，使得在生產(chǎn)過程中造成大量的無機鹽污染，不僅使得環(huán)境二次污染嚴重，而且得到的過氧化氫酶的活性不高并只能得到酶溶液的現(xiàn)狀，提供了一種以豆腐為原料，首先向其中加入氫氧化氫溶液和磷酸混合均勻，隨后將混合物中倒入調(diào)酒液，并用氮氣排出空氣，發(fā)酵后收集發(fā)酵物表面菌絲，之后收集得到的發(fā)酵物菌絲放入培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，并倒入豬皮表面，再次進行發(fā)酵處理，最后將得到的發(fā)酵物取出離心后，噴霧干燥，收集干燥物，從而得到過氧化氫酶的制備方法。該方法操作簡便，在制備的過程中避免了無機鹽的使用，對于環(huán)境無任何二次污染，不僅制得的過氧化氫酶的活性高，而且制得的過氧化氫酶為干品，更好穩(wěn)定，具有更好的緩釋作用。
[0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(1)稱取2?4kg豆腐放入攪拌機中攪拌成漿狀物，再將其放入燒杯，分別向其中加入600?8001^質(zhì)量分數(shù)為30%的氫氧化氫溶液和200?4001111^!1為6.5的磷酸緩沖液，攪拌均勻，把燒杯移至微波爐中，頻率為80?90Hz，溫度為40?50 °C，保持溫度5?8min;
(2)待上述保溫結(jié)束后，向燒杯中加入120?140mL調(diào)酒液，攪拌均勻后密封燒杯，使用氮氣將燒杯中的空氣排出，控制溫度為35?40 °C，以150r/min攪拌發(fā)酵4?6天后，停止攪拌靜置發(fā)酵2?3天，收集發(fā)酵物表面的菌絲；
(3)按重量百份比計，取40?45份蛋白膏、10?15份血粉、5?10份瓊脂、20?25份質(zhì)量分數(shù)為20%的過氧化氫溶液及10?20份葡萄糖，攪拌均勻，形成培養(yǎng)基，將上述收集的發(fā)酵物表面的菌絲放入培養(yǎng)基中，隨后將培養(yǎng)基放置于振蕩培養(yǎng)箱中，在35?40°C下，以振蕩頻率200?300rpm，振蕩培養(yǎng)2?3天；
(4)取豬皮放入容器中，向其中加入質(zhì)量分數(shù)為5%的鹽酸溶液浸泡豬皮，浸泡時間30?40min后將豬皮取出，使用刀將豬皮外表面的豬毛去除干凈，再將內(nèi)表面的肉質(zhì)去除，再將上述培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)混合物倒在豬皮內(nèi)表面，隨后將豬皮移至發(fā)酵罐；
(5)設(shè)定上述發(fā)酵罐溫度為35?40°C，發(fā)酵4?6天，每4?6hW4mL/min通入空氣，通氣時間5?7min，待發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵物取出，將發(fā)酵混合物放入離心機中，以500?700r/min進行離心分離，收集上清液，將上清液放入噴霧干燥機中進行噴霧干燥，收集干燥物，即可得到過氧化氫酶。
[0009]本發(fā)明制得的過氧化氫酶為淺黃色的粉末;不溶于乙醚、氯仿、乙醇;溶于水;酶活達到12000U/mg以上;pH值為7.2?7.4。
[0010]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:使用時，將本發(fā)明制得的過氧化氫酶放入護膚品中，其中每10?15111]^護膚品中加入0.5?0.8g過氧化氫酶，充分混合均勾，早晚潔面后，取出2?3mL混合液均勻涂抹在臉上，輕輕拍打，直至完全吸收為止，即可。經(jīng)檢測，放入過氧化氫酶的護膚品更加能夠增加表皮上層的細胞氧量，使得皮膚更加細膩，更加有光澤。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明方法獨特新穎，操作簡單易行，在制備的過程中無任何環(huán)境污染，是環(huán)保友好生產(chǎn)工藝；
(2)本發(fā)明在制備的過程中不僅避免了無機鹽的使用，而且制得的過氧化氫酶為干品，性能更加溫度，酶活性更加高，至少達到12000U/mg以上，適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0012]首先稱取2?4kg豆腐放入攪拌機中攪拌成漿狀物，再將其放入燒杯，分別向其中加入600?8001^質(zhì)量分數(shù)為30%的氫氧化氫溶液和200?4001111^!1為6.5的磷酸緩沖液，攪拌均勻，把燒杯移至微波爐中，頻率為80?90Hz，溫度為40?50°C，保持溫度5?8min;待上述保溫結(jié)束后，向燒杯中加入120?140mL調(diào)酒液，攪拌均勻后密封燒杯，使用氮氣將燒杯中的空氣排出，控制溫度為35?40°C，以150r/min攪拌發(fā)酵4?6天后，停止攪拌靜置發(fā)酵2?3天，收集發(fā)酵物表面的菌絲;然后按重量百份比計，取40?45份蛋白膏、10?15份血粉、5?10份瓊脂、20?25份質(zhì)量分數(shù)為20%的過氧化氫溶液及10?20份葡萄糖，攪拌均勻，形成培養(yǎng)基，將上述收集的發(fā)酵物表面的菌絲放入培養(yǎng)基中，隨后將培養(yǎng)基放置于振蕩培養(yǎng)箱中，在35?40°C下，以振蕩頻率200?300rpm，振蕩培養(yǎng)2?3天;隨后取豬皮放入容器中，向其中加入質(zhì)量分數(shù)為5%的鹽酸溶液浸泡豬皮，浸泡時間30?40min后將豬皮取出，使用刀將豬皮外表面的豬毛去除干凈，再將內(nèi)表面的肉質(zhì)去除，再將上述培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)混合物倒在豬皮內(nèi)表面，隨后將豬皮移至發(fā)酵罐;最后設(shè)定上述發(fā)酵罐溫度為35?40 V，發(fā)酵4?6天，每4?6h以4mL/min通入空氣，通氣時間5?7min，待發(fā)酵結(jié)束后將發(fā)酵物取出，將發(fā)酵混合物放入離心機中，以500?700r/min進行離心分離，收集上清液，將上清液放入噴霧干燥機中進行噴霧干燥，收集干燥物，即可得到過氧化氫酶。
[0013]實例I
首先稱取2kg豆腐放入攪拌機中攪拌成漿狀物，再將其放入燒杯，分別向其中加入600mL質(zhì)量分數(shù)為30%的氫氧化氫溶液和200mLpH為6.