一種核酸提取方法及其專用試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種核酸提取方法及其專用試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，在臨床或科研領(lǐng)域中常規(guī)核酸提取方法包括物理法、化學(xué)法、酶法以及上述 方法的組合。物理法包括煮沸、凍融、微波、超聲、顆粒破碎等?；瘜W(xué)法為采用十二烷基硫酸 鈉（SDS)、Trixon、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、螯合樹(shù)脂、吐溫20等裂解后進(jìn)行提取。酶 法為采用蛋白酶K、溶菌酶、植物蛋白酶等裂解后進(jìn)行提取。
[0003] 文獻(xiàn) 1(CN101851617B)、文獻(xiàn) 2(CN103820431A)和文獻(xiàn) 3(CN104450684A)公開(kāi)了用 磁珠法提取病毒或細(xì)菌中核酸的試劑盒及提取方法。該方法主要是通過(guò)裂解液將病毒或細(xì) 菌破碎，破碎后通過(guò)磁珠吸附游離的核酸形成磁珠-核酸復(fù)合物，并在配合磁場(chǎng)的作用下完 成核酸的純化。該方法提取的核酸純度高、完整、可直接用于后續(xù)檢測(cè)，但是存在核酸提取 時(shí)間較長(zhǎng)、操作步驟復(fù)雜、成本昂貴，并在利用磁場(chǎng)-磁珠反復(fù)純化核酸的過(guò)程中造成核酸 流失等問(wèn)題。
[0004] 文獻(xiàn)4(CN104611324A)公開(kāi)了一種全血樣本快速裂解試劑盒及其檢測(cè)方法。該方 法用月桂酰基肌氨酸鈉、二硫蘇糖醇、PH7.4的TE，95 °C孵育2min，并將反應(yīng)產(chǎn)物在12000rpm 離心3min，收集上清取得了全血樣本的核酸提取物。其優(yōu)點(diǎn)為提取的核酸可直接用于聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)。但是該方法存在整個(gè)裂解過(guò)程需要95°C高溫加熱，并且裂解產(chǎn)物需 要離心取上清的純化步驟，其裂解條件苛刻、較為繁瑣，不易被集成到微流控芯片中。
[0005] 文獻(xiàn)5(Chelex_100法和堿性裂解法提取細(xì)菌DNA的比較)公開(kāi)了用Chelex-100法 和堿性裂解法從大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中提取核酸的一種方法。Chelex-100法用提取 液（5%Cheleχ-100，lmmol/LEDTA，l%TritonX-100)，56。C水浴30min，95。C加熱10min ;4 °C、12000g離心3min，取上清即為DNA模板。堿裂解法用Imol/LNaOH 100μΙ 37°C孵育30min， 12000g離心2min，加入lmol/L HCL 100μ1，12000g離心3min，取上清即為DNA模板。兩種方法 核酸提取步驟復(fù)雜，并且提取的核酸不能直接用于后續(xù)擴(kuò)增，需要離心等步驟，才可以進(jìn)行 后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)。
[0006] 不論是上述文獻(xiàn)中提到的磁珠法、熱裂解、堿裂解的核酸提取方法，還是其他常規(guī) 核酸提取方法均普遍存在步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，價(jià)格昂貴、試劑保存條件苛刻，以及核酸提取 物不能直接用于后續(xù)核酸擴(kuò)增，并且難以集成到微流控芯片上等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種核酸提取方法及其專用試劑盒。
[0008] 本發(fā)明提供了一種核酸提取方法，包括如下步驟：
[0009] (1)取樣本液，與A組分混合并反應(yīng)，形成反應(yīng)體系；所述A組分包括氫氧化鈉和二 硫蘇糖醇；
[0010] (2)完成步驟(1)后，取反應(yīng)體系，與B組分混合，得到核酸提取物;所述B組分為B-l 組分或B-2組分;所述B-1組分包括硫酸氫鈉;所述B-2組分包括海藻糖和甘露醇。
[0011]所述步驟（1)的所述反應(yīng)中，氫氧化鈉的濃度為〇. Olmol/L-0.05mol/L，二硫蘇糖 醇的濃度為 0. 〇〇lmol/L-〇. 01mol/L。
[0012] 所述步驟（1)的所述反應(yīng)中，氫氧化鈉的濃度可為0.01m〇l/L-0.02m 〇l/L、 0·02mol/L_0·025mol/L、0·025mol/L_0·05mol/L、0·01mol/L、0·02mol/L、0·025mol/L或 0 · 05mol/L，二硫蘇糖醇的濃度可為0 · 001mol/L-0 · 003mol/L、0 · 003mol/L-0 · 005mol/L、 0·005mol/L_0·01mol/L、0·001mol/L、0·003mol/L、0·005mol/L或0·01mol/L。
[0013] 所述A組分由氫氧化鈉和二硫蘇糖醇組成。所述B-l組分為硫酸氫鈉。所述B-2組分 由海藻糖和甘露醇組成。所述步驟（1)中，具體將80微升樣本液與A組分混合。所述步驟(2) 中，將步驟(1)得到的所有反應(yīng)體系與B組分混合。
[0014] 所述A組分為含有氫氧化鈉和二硫蘇糖醇的水溶液。所述B-1組分為硫酸氫鈉水溶 液。所述B-2組分為含有海藻糖和甘露醇的水溶液。所述步驟（1)中，1體積份A組分與9體積 份樣本液混合。所述步驟(1)中，具體將10微升A組分與90微升樣本液混合。所述步驟(2)中， 3體積份反應(yīng)體系與2體積份B組分混合。
[0015] 所述步驟(2)的所述混合后，硫酸氫鈉的濃度為0.0044m〇l/L-0.32m 〇l/L。
[0016] 所述步驟（2)的所述混合后，硫酸氫鈉的濃度可為0.0044m〇l/L-0.032m 〇l/L、 0·032mol/L-0·176mol/L、0·176mol/L-0·32mol/L、0·0044mol/L、0·032mol/L、0·176mol/L 或0.32mol/L。
[0017] 所述步驟（2)的所述混合后，海藻糖的濃度為13.5g/L-80g/L，甘露醇的濃度為 10.5g/L-80g/L〇
[0018] 所述步驟（2)的所述混合后，海藻糖的濃度可為13.5g/L-20g/L、20g/L-36g/L、 36g/L-80g/L、13.5g/L、20g/L、36g/L 或 80g/L，甘露醇的濃度可為 10.5g/L-20g/L、20g/L-28g/L、28g/L-80g/L、10.5g/L、20g/L、28g/LS80g/L。
[0019] 所述步驟(1)中，所述反應(yīng)的條件為(bl)或(b2):
[0020] (bl)溫度為 20。0105。(：；
[0021] (b2)溫度為 50。〇75。(：。
[0022] 所述步驟（1)中，所述反應(yīng)的條件為：溫度為65°C、時(shí)間為5-30min(例如5!^11-15min、15min_30min、5min、15min或30min)〇
[0023] 所述樣本液為動(dòng)物體液和/或微生物培養(yǎng)物。
[0024] 所述核酸提取方法為提取微生物和/或動(dòng)物核酸的方法。
[0025] 所述微生物具體可為鴨瘟病毒或人類(lèi)皰疹病毒。所述動(dòng)物體液具體可為離體的動(dòng) 物體液，更具體可為人類(lèi)唾液。
[0026] 本發(fā)明還提供了一種用于生物核酸提取的試劑盒，包括A組分和B組分;所述A組分 包括氫氧化鈉和二硫蘇糖醇;所述B組分為B-1組分或B-2組分;所述B-1組分包括硫酸氫鈉； 所述B-2組分包括海藻糖和甘露醇。
[0027] 所述A組分由氫氧化鈉和二硫蘇糖醇組成。所述B-1組分為硫酸氫鈉。所述B-2組分 由海藻糖和甘露醇組成。
[0028] 所述A組分為含有氫氧化鈉和二硫蘇糖醇的水溶液。所述B-1組分為硫酸氫鈉水溶 液。所述B-2組分為含有海藻糖和甘露醇的水溶液。
[0029] 所述A組分可為A液。所述A液為含有0.1mol/L-0.5m〇VL氫氧化鈉和0.01mol/L-0. lmol/L二硫蘇糖醇的水溶液。所述A液中，所述氫氧化鈉的濃度可為0. lmol/L-0.2mol/L、 0·2mol/L_0·25mol/L、0·25mol/L_0·5mol/L、0·lmol/L、0·25mol/L、0·2mol/L或0·5mol/L〇 所述A液中，所述二硫蘇糖醇的濃度可為0 · Olmol/L-O · 03mol/L、0 · 03mol/L-0 · 05mol/L、 0 · 05mol/L_0 · lmol/L、0 · 01mol/L、0 · 03mol/L、0 · 05mol/L或0 · lmol/L。所述A液具體可為含 有0. lmol/L氫氧化鈉和0.0 lmol/L二硫蘇糖醇的水溶液。所述A液具體可為含有0.2mol/L氫 氧化鈉和0.05mol/L二硫蘇糖醇的水溶液。所述A液具體可為含有0.5mol/L氫氧化鈉和 0. lmol/L二硫蘇糖醇的水溶液。所述A液具體可為含有0.25mol/L氫氧化鈉和0.03mol/L二 硫蘇糖醇的水溶液。
[0030] 所述B-1組分可為B-1液。所述B-1液為0.08mol/L-0.8m〇VL硫酸氫鈉水溶液。所述 B-1液中，所述硫酸氫鈉的濃度為0.08mol/L_0.44mol/L、0.44mol/L_0.8mol/L、0.08mol/L、 0.44mol/L或0.8mol/L。所述B-1液具體可為0.08mol/L硫酸氫鈉水溶液。所述B-1液具體可 為0.44mol/L硫酸氫鈉水溶液。所述B-1液具體可為0.8mol/L硫酸氫鈉水溶液。
[0031] 所述B-2組分可為B-2液。所述B-2液為含有50g/L-200g/L海藻糖和50g/L-200g/L 甘露醇的水溶液。所述B-2液中，海藻糖的濃度可為50g/L-90g/L、90g/L-200g/L、50g/L、 90g/L或200g/L。所述B-2液中，甘露醇的濃度可為50g/L-70g/L、70g/L-200g/L、50g/L、70g/ L或200g/L。所述B-2液具體可為含有50g/L海藻糖和50g/L甘露醇的水溶液。所述B-2液具體 可為含有90gAJ|藻糖和70 g//L甘露醇的水溶液。所述B-2液具體可為含有200g/L海藻糖和 200g/L甘露醇的水溶液。
[0032] 所述A組分可為A組件。所述A組件為裝有氫氧化鈉和二硫蘇糖醇的反應(yīng)容器。