轉(zhuǎn)基因大豆事件b4j8049外源插入片段旁側(cè)序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種抗病轉(zhuǎn)基因大豆事件B4J8049外源 插入片段旁側(cè)序列以及用于檢測(cè)該序列的PCR引物，本發(fā)明還涉及利用該引物對(duì)轉(zhuǎn)基因大 豆事件B4J8049進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆疫霉根腐?。≒hytophthora root rot, PRR)是由大豆疫霉菌（Phytophthora so jae)引起的一類土傳檢疫性病害。該病原菌在大豆整個(gè)生育期都能侵染大豆并造成危 害，導(dǎo)致早期大豆?fàn)€種、猝倒和中后期根、莖腐爛。大豆疫霉根腐病在全球各大豆主產(chǎn)區(qū)均 有發(fā)生，每年造成大豆產(chǎn)量損失超過10億美元，是危害大豆生產(chǎn)的毀滅性病害之一。我國自 1989年首次在東北地區(qū)分離到該病原菌以來，隨著國外大豆品種的不斷引入，大豆疫霉根 腐病在我國大豆主要產(chǎn)區(qū)特別是東北大豆主產(chǎn)區(qū)的發(fā)生和為害程度逐步加重。一般發(fā)病率 在5%左右，感病品種一般減產(chǎn)25 %-50%，高感品種可達(dá)90%以上。嚴(yán)重地塊的大豆植株成片 枯死，甚至絕產(chǎn)，對(duì)我國大豆生產(chǎn)構(gòu)成巨大的潛在威脅。
[0003]大豆疫霉菌為寄主?；圆≡瑢俦廾鷣嗛T卵菌綱疫霉屬。該病原菌生理小 種分化明顯，自1965年首次報(bào)道1號(hào)、2號(hào)生理小種以來，目前已報(bào)道的大豆疫霉菌生理小種 至少有55種以上(Leiz RA等，2000)，且不同地區(qū)的生理小種分布不同。朱正東和馬淑梅等 (2005)對(duì)我國東北地區(qū)大豆疫霉菌生理小種分布情況鑒定表明，該地區(qū)疫霉菌生理小種組 成多樣化，包括1號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、13號(hào)、15號(hào)等，其中1號(hào)生理小種為優(yōu)勢(shì)種群，占鑒定小種數(shù)量 的60%以上。目前生產(chǎn)上對(duì)大豆疫霉菌的防治主要采用種植抗病品種，改進(jìn)栽培措施和化學(xué) 防治等方法。由于大豆疫霉根腐病為土傳病害，采用化學(xué)防治較為困難，且常用的化學(xué)殺菌 劑如甲霜靈等并不是對(duì)所有生理小種都有效。輪作等栽培措施雖然可以在一定程度上減緩 病原菌的危害，但并不能夠完全控制病害，且在大豆實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用具有一定的局限性?？?病品種的培育和種植是防治大豆疫霉根腐病最為經(jīng)濟(jì)、有效和環(huán)境安全的措施。
[0004]目前在大豆資源中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)對(duì)疫霉根腐病存在小種特異性抗性的大豆品種，攜 帶 1個(gè)或多個(gè)抗性基因如Rpsla、Rpslb、Rpsld、Rpslk、Rps3a、Rps3b、Rps3c、Rps4、Rps5、 Rps6、Rps7、Rps8等。由單一抗性基因 Rps介導(dǎo)的抗性，在受到病原菌侵染后，通常會(huì)引發(fā)寄 主產(chǎn)生超敏感反應(yīng)(hypersensitive response，HR)，從而對(duì)病原產(chǎn)生較強(qiáng)的抗性。但由于 單基因控制的抗性極易造成病原生理小種的快速分化，導(dǎo)致新的病原小種產(chǎn)生并對(duì)原有抗 病品種產(chǎn)生抗性。由于抗源基礎(chǔ)狹窄，病原生理小種毒性類型復(fù)雜，而且變化很快，新的小 種不斷出現(xiàn)，利用常規(guī)育種方法育成的大豆疫霉根腐病抗病品種的平均使用壽命很短，易 出現(xiàn)抗性退化等方面問題。因此，如何進(jìn)一步拓寬大豆霉根腐病抗源基礎(chǔ)，提高大豆抗疫霉 根腐病水平及抗性持久性，延緩病原生理小種的進(jìn)化速度，對(duì)于減少大豆病害的發(fā)生，提高 大豆產(chǎn)量和保護(hù)環(huán)境等方面均具有重要的意義。
[0005]目前國際上利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大豆疫霉根腐病抗性的研究較少。Sumit R.等 (2012)報(bào)道利用擬南芥非宿主抗性基因 pssl轉(zhuǎn)化大豆品種，轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)疫霉根腐病的抗 性顯著提高。Fan S等(2015年)研究表明，編碼抗菌活性蛋白基因 Gly m 41在大豆中的過量 表達(dá)可以顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因大豆抗疫霉根腐病能力。國內(nèi)郭玉雙等(2006)在大豆中過表達(dá)菜 豆幾丁質(zhì)酶基因 chi和大豆核糖體失活蛋白基因 rip，獲得抗性水平較受體品種明顯提高的 轉(zhuǎn)基因大豆株系。我們采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將我國自主克隆的廣譜抗病基因 hrpZPsta按照大豆 偏愛性密碼子進(jìn)行人工優(yōu)化，并導(dǎo)入栽培大豆基因組，獲得了一個(gè)對(duì)疫霉根腐病抗性水平 顯著提高的轉(zhuǎn)基因大豆事件B4J8049。該轉(zhuǎn)基因大豆事件已進(jìn)入環(huán)境釋放，今后有可能進(jìn)入 商業(yè)化種植。對(duì)轉(zhuǎn)基因事件進(jìn)行特異性檢測(cè)，能更好的對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行監(jiān)督管理，而外源 插入片段的旁側(cè)序列和根據(jù)此旁側(cè)序列建立的檢測(cè)方法，是對(duì)轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品進(jìn)行有 效監(jiān)督管理的一個(gè)重要依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗病轉(zhuǎn)基因大豆事件B4J8049外源插入片段旁側(cè)序列 以及用于檢測(cè)該序列的PCR引物。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因大豆事件的特異性PCR檢測(cè)方法和試劑 盒。
[0008] 本發(fā)明提供的抗病轉(zhuǎn)基因大豆事件B4J8049按如下方式獲得： 根據(jù)大豆密碼子偏愛性對(duì)hrpZPstaS因序列進(jìn)行人工優(yōu)化，新序列命名為hrpZm，序列 如SEQ-2所示。優(yōu)化序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并連接到克隆載體pUC-57 上，構(gòu)建載體pUC57-hrpZm。分別用Pstl/Xbal雙酶切pUC57-Gmubi3和中間載體pTF101-35S， 膠回收Gmubi3酶切片段和pTF101-35S酶切大片段，并利用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建中間表 達(dá)載體pTF101-Gmubi3。采用同樣的方法，利用Xbal/SacI雙酶切pUC57-hrpZm質(zhì)粒和中間載 體pTF101-Gmubi3,回收hrpZm酶切片段和pTF101-Gmubi3酶切大片段，構(gòu)建植物表達(dá)載體 pTF101-Gmubi3_hrpZm。載體中目的基因 hrpZm位于大豆組成型強(qiáng)啟動(dòng)子Gmubi3下游，終止 子為nos。構(gòu)建載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0009] 采用凍融法將pTF101-Gmubi3-hrpZm質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA101。利用浸泡24小時(shí)的 大豆種子作為外植體。沿大豆種臍部位將大豆種子剖開，并在子葉節(jié)位置輕微劃傷處理后， 用攜帶載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染。共培養(yǎng)4天后，在含6m g//L草丁膦的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行 連續(xù)3輪篩選培養(yǎng)。篩選獲得的抗性芽經(jīng)誘導(dǎo)伸長和生根后再生為完整的小植株。再生苗移 栽至溫室中開花、結(jié)實(shí)。經(jīng)連續(xù)多代PCR檢測(cè)和田間除草劑(BASTA)噴施篩選，獲得轉(zhuǎn)基因大 豆事件B4J8049。
[0010] 采用Southern雜交檢測(cè)及轉(zhuǎn)基因后代外源片段分離比例分析，確定該轉(zhuǎn)基因事件 外源片段為單拷貝插入。Southern雜交檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。連續(xù)多代接種疫霉菌結(jié)果表 明，轉(zhuǎn)基因事件B4J8049對(duì)大豆疫霉根腐病具有較好的抗性。
[0011]本發(fā)明提供了抗病轉(zhuǎn)基因大豆事件B4J8049外源插入片段右邊界旁側(cè)序列， 其具有SEQ-1所示的序列或其特異性片段或互補(bǔ)于該序列的序列。
[0012] 本發(fā)明提供了 SEQ-1所示序列在檢測(cè)抗病轉(zhuǎn)基因大豆事件B4J8049包括親本、衍生 品系或品種，及其制品包括植株、組織、種子及產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0013] 鑒于獨(dú)立轉(zhuǎn)基因事件中，外源T-DNA片段在植物基因組中的整合具有隨機(jī)性的特 點(diǎn)，不同轉(zhuǎn)基因事件其外源片段在基因組中的插入位點(diǎn)不同。對(duì)于特定的轉(zhuǎn)基因事件來說， 其旁側(cè)序列是特異的。因此，應(yīng)用插入片段旁側(cè)序列可以對(duì)轉(zhuǎn)基因事件進(jìn)行特異性檢測(cè)。如 利用包含部分旁側(cè)序列和部分外源插入片段序列的探針進(jìn)行雜交，或是設(shè)計(jì)包含部分旁側(cè) 序列和部分外源插入片段序列的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增等?？梢愿鶕?jù)5'端旁側(cè)序列設(shè)計(jì) 上游引物，外源插入片段序列設(shè)計(jì)下游引物，擴(kuò)增特異性片段;或是根據(jù)外源插入片段序列 設(shè)計(jì)上游引物，3'端旁側(cè)序列設(shè)計(jì)下游引物，擴(kuò)增特異性片段。
[00M]本發(fā)明還提供了用于擴(kuò)增SEQ-1所示序列的特異性引物。
[0015] 在本發(fā)明提供的一個(gè)實(shí)施例中，提取轉(zhuǎn)基因大豆事件B4J8049葉片基因組DNA，利 用特異性引物和高簡并性隨機(jī)引物進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增，獲得外源片段在轉(zhuǎn)基因大豆基因組 中整合位點(diǎn)的右邊界l〇27bp序列。包括第1 一993bp大小為993bp的大豆基因組序列和第 994一 1027bp大小為34bp的外源片段序列，如SEQ-1所示序列。分析外源片段整合位點(diǎn)的右 邊界序列，根據(jù)插入片段右邊界左側(cè)序列(T-DNA區(qū)內(nèi)）設(shè)計(jì)特異性上游引物財(cái)北049? :5'_ TTTCCCGCCTTCAG TTTAAACTATCAG-3 '（ SEQ-5);根據(jù)大豆基因組序列設(shè)計(jì)特異性下游引物 B4J8049R: 5'-GACGCCGTCAACAATGGTGAAC-3'（SEQ-6)。利用PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得 1010bp 特異性片段，包括第1 一976bp大小為976bp的大豆基因組序列和第977-1010bp大小為34bp 的外源片段序列（SEQ-7)。
[0016] 本發(fā)明提供了上述引物在制備檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆試劑盒中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明提供了一種檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆事件B4J8049的方法，以大豆樣品總DNA為模 板，利用本發(fā)明提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)PCR產(chǎn)物的電泳片段判斷結(jié)果。
[0018] 上述檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆事件B4J8049的方法，其PCR反應(yīng)體系（25uL)為：10 X PCR緩沖 液2.5uL，10mmol/L dNTPs 0.5uL, 5U/uL Taq酶0.5uL，大豆樣品總DNA 1.0uL，10umol/L上 游引物0.5 uL，10umol/L下游引物0.5 uL，ddH20 19.5 uL〇
[0019] PCR反應(yīng)條件為：95°