miR-126-3p在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種miR-126-3p在豬卵巢顆 粒細(xì)胞中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在商品豬肉生產(chǎn)中，母豬的利用年限直接關(guān)系到豬場的經(jīng)濟(jì)效益。影響母豬利用 年限的因素主要有繁殖障礙、自然環(huán)境、品種、營養(yǎng)、疾病等，其中繁殖障礙是導(dǎo)致母豬過早 從豬群中淘汰的最主要原因之一。在母豬繁殖障礙中卵巢的疾病是一個重要誘因。
[0003] 卵巢是哺乳動物重要的生殖腺，是卵泡發(fā)育和排卵的重要繁殖器官。卵泡作為卵 巢的基本組成單位，維持著卵子的存在、發(fā)育與閉鎖。顆粒細(xì)胞是卵泡周圍扁平或立方狀細(xì) 胞，其生長與分化在卵泡的發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。雌性哺乳卵巢中僅有少數(shù)卵 泡能夠發(fā)育成熟并排卵，而絕大部分卵泡在發(fā)育的各個階段發(fā)生閉鎖退化，其重要且直接 原因來自于顆粒細(xì)胞的凋亡。顆粒細(xì)胞的凋亡是啟動卵泡閉鎖的重要機(jī)制。
[0004] Micr〇RNAS(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA，其大小長約20~25個核苷酸。它主要通過與靶基因 mRNA的3'端非翻譯區(qū)（UTR)完全或 不完全配對而降解祀mRNA或抑制mRNA的正常翻譯，進(jìn)而對基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。近年 來，關(guān)于哺乳動物卵巢發(fā)育的miRNA調(diào)控也受到研究者關(guān)注，多項研究表明miRNA廣泛參與 卵子發(fā)生、卵泡發(fā)育、閉鎖和黃體形成、退化等多個生物學(xué)過程。MiRNA還參與一些卵巢疾病 的調(diào)控，主要有卵巢癌和卵巢早衰。
[0005] 本發(fā)明前期研究中，通過Solexa高通量測序技術(shù)，鑒定不同發(fā)育時期（3月齡青年 母豬，3胎齡母豬，繁殖障礙母豬)母豬卵巢組織miRNA表達(dá)譜，其中miR-126-3p呈顯著差異 表達(dá)，推測其可能在顆粒細(xì)胞中發(fā)揮重要調(diào)控作用。
[0006] 目前研究中，由于miRNA與靶基因之間的關(guān)系是多對多，且動物的一種表型變化， 很難通過一個miRNA和其靶基因調(diào)控來控制，基本很難進(jìn)行活體豬個體水平驗證;另外，在 沒有較高把握成功的實驗情況下，用豬做活體實驗的成本太高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種miR-126_3p在豬卵 巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0008] 通過基因工程技術(shù)改變該miRNA在顆粒細(xì)胞的表達(dá)量，進(jìn)而影響其對顆粒細(xì)胞的 凋亡;通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測該miRNA靶基因，研究靶基因的功能，來達(dá)到該miRNA在豬卵 巢顆粒細(xì)胞中應(yīng)用的目的。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述的miR-126-3p的靶基因。
[0010] 本發(fā)明的再一目的在于通過所述的靶基因的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：
[0012] 本發(fā)明提供一種miR-126-3P在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0013] 所述的miR-126-3p的靶基因為PIK3R2和TSC1。
[0014] 所述的靶基因 PIK3R2和TSC1在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用。
[0015] 在顆粒細(xì)胞中補(bǔ)充外源干擾的靶基因 PIK3R2和TSC1后，能回復(fù)由miR-126-3p引起 的細(xì)胞功能表型。
[0016]所述的砧1?-126-3口的序列為5/-1^1；1^01^^61^厶1^厶1?〇6-3/;
[0017]本發(fā)明的驗證結(jié)果如下：
[0018] 1、制備miR-126_3p模擬物(mimic)和抑制劑（inhibitor)及檢測轉(zhuǎn)染效率。在顆粒 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-126-3p mimic和miR-126-3p inhibitor，通過qRT-PCR手段，檢測其轉(zhuǎn)染效 率，其中分別轉(zhuǎn)染濃度為50nM的miR-126_3p mimics，以及ΙΟΟηΜ的miR-126_3pinhibitor 后，相對于各自轉(zhuǎn)染的對照組NC，實驗組的轉(zhuǎn)染效率分別能達(dá)到超表達(dá)2000多倍和抑制10 多倍。
[0019] 2、通過轉(zhuǎn)染達(dá)上述效率的miR-126_3p mimic和miR-126_3p inhibitor后，檢測標(biāo) 記基因的表達(dá)量，以及顆粒細(xì)胞凋亡的變化。通過qRT-PCR手段，檢測miR-126_3p介導(dǎo)的凋 亡標(biāo)記基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-126_3p(即轉(zhuǎn)染miR-126_3p mimic)抑制了促凋亡標(biāo)記 基因 Caspase-3的表達(dá)，促進(jìn)了抑凋亡標(biāo)記基因 BCL2的表達(dá)。并通過Annexin V-FITC法檢測 miR-126-3p對顆粒細(xì)胞凋亡影響，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-126-3p抑制顆粒細(xì)胞凋亡，而抑制 miR-126_3p促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。
[0020] 3、生物信息學(xué)軟件預(yù)測豬miR-126-3p的靶基因，實驗證實其靶基因為PIK3R2和 TSC1 JargetScaruMiRandaARNAhybrid 3個生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-126_3p祀基因，運用 K0BAS 2.0軟件，對預(yù)測的靶基因進(jìn)行作用通路分析，發(fā)現(xiàn)其靶向PI3K(磷脂酰肌醇3-激 酶)-AKT (絲氨酸蛋白激酶)通路中關(guān)鍵PIK3R2 (磷酸酯酶基因）、TSC1 (3-磷酸肌醇依賴激 酶)基因，發(fā)現(xiàn)PIK3R2和TSC1 3^JTR中含有miR-126-3p序列結(jié)合位點，將PIK3R2和TSC1野生 型3'UTR和含有種子序列突變的3'UTR構(gòu)建到真核表達(dá)載體pmirGLO中，通過雙熒光素酶報 告分析，發(fā)現(xiàn)PIK3R2和TSC1野生型30JTR上游報告基因受到miR-126-3p調(diào)控，而突變型不受 miR-126_3p調(diào)控。還采用qRT-PCR和We stern blot ting在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平驗證miR-126-3p調(diào)控PIK3R2和TSC1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-126-3p在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平下調(diào)PIK3R2表達(dá)，只 在翻譯水平下調(diào)TSC1表達(dá)。
[0021 ] 4、合成 3 對靶基因 PIK3R2 和 TSC1 干擾小片段 / 對照（siRNA-PIK3R2，siRNA-TSCl/ siRNA-NC)，篩選并檢測其干擾效率。轉(zhuǎn)染基因干擾小片段到顆粒細(xì)胞中，通過qRT-PCR手 段，最終篩選干擾效果較好的siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3小片段進(jìn)行后續(xù)實驗。
[0022] 5、PIK3R2 和 TSC1 干擾小片段(siRNA-PIK3R2-l 和 siRNA-TSCl-3)轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞，研 究靶基因 PIK3R2和TSC1對豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的應(yīng)用。通過Annexin V-FITC法檢測PIK3R2 和TSC1受到siRNA-PIK3R2-l和siRNA-TSCl-3小片段干擾后的顆粒細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn) PIK3R2和TSC1促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。
[0023] 6、miR-126-3p靶基因 PIK3R2和TSC1功能回復(fù)驗證。在顆粒細(xì)胞中補(bǔ)充外源干擾的 靶基因 PIK3R2和TSC1后，能否回復(fù)由miR-126-3p引起的細(xì)胞功能表型。顆粒細(xì)胞共轉(zhuǎn)染 miR-126-3p inhibitor/NC和PIK3R2和TSC1 干擾小片段（siRNA-PIK3R2-l和8丨1?祖-了5(：1-3)/siRNA-NC，通過Annexin V-FITC法檢測顆粒細(xì)胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)，miR-126-3p引起的抑 制顆粒細(xì)胞凋亡的功能能夠被PIK3R2和TSC1回復(fù)。
[0024]本發(fā)明以miR-126_3p為研究對象，采用了細(xì)胞生物學(xué)方法研究其在豬卵巢顆粒細(xì) 胞中的應(yīng)用。關(guān)鍵點和欲保護(hù)點：（l)miR-126-3p在豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用；（2)在豬 卵巢顆粒細(xì)胞中miR-126-3p與基因 PIK3R2和TSC1靶向關(guān)系；（3)基因 PIK3R2和TSC1在豬卵 巢顆粒細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用；（4)通過靶基因回復(fù)實驗，即在顆粒細(xì)胞中補(bǔ)充外源干擾的靶基 因 PIK3R2和TSC1后，驗證能否回復(fù)由miR-126-3p引起的細(xì)胞功能表型。
[0025]顆粒細(xì)胞的凋亡是啟動卵泡閉鎖的重要機(jī)制，本發(fā)明第一次證實miR-126_3p、 PIK3R2在豬卵巢顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用，以及在豬卵巢顆粒細(xì)胞中miR-126-3p與基因 PIK3R2和 TSC1之間的靶向關(guān)系;現(xiàn)在的發(fā)明關(guān)于靶基因功能回復(fù)實驗僅有少量報道，出現(xiàn)這樣的原 因主要是一種表型的變化受到多方面的影響，并且miRNA與靶基因之間的關(guān)系是多對多，即 一個miRNA可以靶向多個基因，一個基因也可以是多個miRNA的靶標(biāo)，所以靶基因的回復(fù)實 驗很難得到結(jié)果，不過，本發(fā)明補(bǔ)充外源干擾的PIK3R2和TSC1能夠回復(fù)由miR-126-3p引起 的細(xì)胞功能表型，進(jìn)一步表明PIK3R2和TSC1在顆粒細(xì)胞中是miR-126-3p的重要功能靶標(biāo)， miR-126-3p可以通過PIK3R2和TSC1來調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的發(fā)育。
[0026]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及效果：
[0027]本發(fā)明設(shè)計周詳，結(jié)果可靠。為證明miR-126_3p在顆粒細(xì)胞中的應(yīng)用，本發(fā)明除了 研究其自身功能以外還通過靶基因以及靶基因在顆粒細(xì)胞中的功能進(jìn)行研究;本發(fā)明還通 過靶基因回復(fù)實驗，即在顆粒細(xì)胞中補(bǔ)充外源干擾的靶基因 PIK3R2和TSC1后，驗證能否回 復(fù)由miR-126-3p引起的細(xì)胞功能表型。
【附圖說明】
[0028] 圖 1 是qRT-PCR檢測miR-126-3p mimic和miR-126-3p inhi