抗草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶、表達載體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領域、分子生物學領域。具體地，本發(fā)明涉及一種新型的抗 草甘勝的5_烯醇丙酮莽草酸_3_憐酸合成酶（5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)，以及編碼上述合成酶的核酸序列，包含該序列或其編碼片段的核酸構建 體，攜有該序列或其編碼片段或攜有所述核酸構建體的載體，以及用所述構建體或載體轉 化的宿主細胞。另外，本發(fā)明也涉及上述新型5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，編碼該 合成酶的核酸序列、核酸構建體，重組表達載體以及用所述構建體或載體轉化的宿主細胞 的使用。
【背景技術】
[0002] 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用除草劑進行雜草防治，但是除草劑常常在殺滅農(nóng)作物中雜 草的同時會對農(nóng)作物本身產(chǎn)生危害，而且會傷害許多商業(yè)作物和雙子葉植物，如大豆、棉 花、馬鈴薯、油菜。利用轉基因方法可以將抗除草劑基因導入農(nóng)作物，從而使該農(nóng)作物獲得 除草劑耐受能力，因此使用除草劑能夠選擇性地殺滅雜草。在農(nóng)田中噴灑除草劑只會殺滅 雜草但是不會對轉基因的農(nóng)作物產(chǎn)生藥害，這樣的系統(tǒng)被稱為除草劑-抗除草劑的作物配 套系統(tǒng)。
[0003] 目前，一些抗除草劑基因已經(jīng)被成功地應用于除草劑-抗除草劑的作物配套系 統(tǒng)。例如抗2,4-二氯苯氧乙酸的tfdA基因，抗溴苯腈的BXN基因和抗草丁膦的bar基因 和pat基因等。導入上述除草劑的植物細胞以及植株已被證明具有抗相應除草劑的功能。
[0004] 草甘膦屬有機磷類內吸傳導型滅生性除草劑，可以殺死雜草和植物。由于草甘膦 有效且生產(chǎn)成本低，對環(huán)境保護好，理化性質穩(wěn)定并具有高效、廣譜、低毒、低殘留、易分解、 不破壞土壤環(huán)境和對大多數(shù)植物具有強滅生性等優(yōu)點，目前已是世界范圍內應用最為廣 泛、非常重要的一種除草劑。但部分細菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶已發(fā)現(xiàn)對草 甘膦具有抗性，因此通過基因工程被分離獲得，經(jīng)過轉基因技術表達細菌的抗草甘膦功能 而獲得抗草甘膦的能力。但是為了抗性基因的多樣性，生產(chǎn)應用中仍然需要新的抗草甘膦 基因和以此為基礎的抗草甘膦植物。然而，一種細菌的EPSPS是否抗草甘膦以及抗性的高 低，是不能通過EPSPS的氨基酸序列預測的。本發(fā)明提供一種新型抗草甘膦基因，該基因具 有很高的抗草甘膦能力，可以用來產(chǎn)生抗草甘膦植物，也可作為微生物和植物細胞培育中 的篩選標記。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明是一種新型的抗草甘膦5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶以及編碼此酶 的核酸序列，用于轉到寄主包括植物中，使得寄主特別是植物能耐受草甘膦，并且可以利 用本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶清除受草甘膦污染的資源。
[0006] 本發(fā)明一個目的是涉及編碼草甘膦耐受型EPSPS基因的核酸序列（SEQ ID N〇:2)， 以及其編碼的氨基酸序列（SEQ ID N〇:l)，并克隆了其基因片段。該基因片段的序列與現(xiàn)有 技術中的土壤桿菌CP4 (Agrobacterium sp. CP4)抗草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸 合成酶基因序列存在差異性，通過同源性比對，結果只有47.8%的同源性（圖1)。證實了 該基因是新發(fā)明的。
[0007] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種由上述核酸序列與使上述核酸序列在相應宿主 細胞中表達所必需的調控序列可操作地連接而形成的核酸構建體。所述調控序列具體可任 選包括啟動子、增強子、前導序列、聚腺苷酸化信號、以及轉錄和翻譯的起始和終止序列。
[0008] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種含有上述核酸序列或核酸構建體的載體。
[0009] 本發(fā)明還同時提供了一種轉基因植物細胞、部分宿主生物和完整的宿主生物，其 包含上述核酸序列。該植物細胞可以在適當?shù)臈l件下表達上述核酸序列所編碼的蛋白，并 使該蛋白具有EPSPS酶活性以及降解草甘膦的能力，從而使該轉化的植物細胞具有草甘膦 耐受性。
[0010] 本發(fā)明還有一個目的是提供上述植物細胞及其后代細胞，這些細胞中含有上述核 酸序列或其編碼片段、核酸構建體或載體，并且這些細胞具有草甘膦耐受性。
[0011] 本發(fā)明還有一個目的是提供一個在田間利用此類5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合 成酶轉化的植物和使用草甘膦的除草方法。在植物的生長過程中，噴灑草甘膦。由于此類 5_烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因轉化的植物具有草甘膦耐受性，噴灑的草甘膦可以 殺死雜草，但不殺死5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因轉化的植物。因此利用草甘膦 可以選擇性地控制植物生長中的雜草，不影響轉化了的植物的生長。
[0012] 本發(fā)明還有一個目的是進一步提供了清除草甘膦對一些材料的污染的方法。此方 法包括利用本發(fā)明的微生物以及此類微生物的提取物或其產(chǎn)物，如分解草甘膦的5-烯醇 丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，能分解草甘膦，使其不對環(huán)境產(chǎn)生危害。
[0013] 本發(fā)明還有一個目的是利用草甘膦耐受性的選擇性標記基因篩選轉化的植物細 胞或植物的方法。此方法包括用本發(fā)明的此類核酸轉化至其中一部分植物細胞中，在含有 草甘膦的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使得轉化的植物細胞可以生長；而非轉化的植物細胞不能生長。此 方法也包括轉化本發(fā)明的此類核酸的植物的篩選，其中成功轉化的植物在噴灑草甘膦時可 以生長，而未轉化的植物不能生長。
[0014] 本發(fā)明的其他目的還可以體現(xiàn)在以下對本發(fā)明的詳細描述以及具體實施例中。
[0015] 本發(fā)明提供了從土壤及污水中分離的一種菌株，它能破壞除草劑草甘膦的活性， 避免在噴灑草甘膦時對宿主包括植物產(chǎn)生有害影響。此外，本發(fā)明還提供了一種從該菌中 分離的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶，發(fā)揮著重要的作用，該酶發(fā)揮其降解草甘膦的 能力。
[0016] 本發(fā)明提供了一種抗草甘膦的EPSPS基因，并對該EPSPS基因克隆，對其進行序 列測定，如序列表中SEQ ID N〇:2所示。本發(fā)明的EPSPS基因序列與上述提到的土壤桿菌 CP4 (Agrobacterium sp. CP4)的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因氨基酸序列只有 47. 8%的同源性，核酸序列差異明顯。
[0017] 本發(fā)明還提供了上述核苷酸序列的變體，例如在該序列的基礎上進行任何改動， 如剪切、插入或替換一個或多個核苷酸，通過檢測鑒定，如果所得新的核酸序列能編碼具有 EPSPS活性的蛋白，那么就屬于本發(fā)明的內容。
[0018] 本發(fā)明還同時提供了上述基因編碼的草甘膦蛋白，該蛋白質的氨基酸序列如序列 表中SEQ ID No:l所示。
[0019] 本發(fā)明中抗草甘膦的蛋白質也可以用人工方法引入一個或多個變異而獲得保持 有抗草甘膦能力的變異分子，比如對該序列進行剪切、插入或替換一個或多個氨基酸殘基， 通過篩選獲得具有抗草甘膦能力的新的蛋白質分子，屬于本發(fā)明的內容。
[0020] 將本發(fā)明編碼EPSPS的核苷酸序列與相對于該序列同源或異源的其它序列可操 作地連接，就構成本發(fā)明的核酸構建體。本發(fā)明的抗草甘膦基因的核酸片段可以進一步構 建包含表達構件的植物轉化質粒。這個表達構件包括啟動子、抗草甘膦基因和終止子。
[0021] 這個抗草甘膦基因表達構件可以通過植物的轉化被整合到植物的基因組中，從而 穩(wěn)定遺傳和表達。該表達構件可以通過農(nóng)桿菌或基因槍等方法導入植物的未成熟胚、成熟 胚、未分化的愈傷組織或原生質體中表達。
[0022] 利用本發(fā)明的基因所編碼的蛋白質序列，可以設計和人工合成密碼子優(yōu)化的有利 于在植物中表達的核苷酸序列。只要該序列具有草甘膦耐受性，就屬于本發(fā)明的范圍。利 用DNA2. 0等軟件對該基因的序列進行密碼子優(yōu)化，利用生物學軟件DNAMAN等對優(yōu)化后的 序列作限制性酶切分析，對含有常見酶切位點的密碼子進行同義修飾，消除常用酶切位點。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的方法，可將本發(fā)明的核酸構建體，或者直接將本發(fā)明的分離的核酸 序列導入載體，用該載體轉化特定的宿主細胞，從而表達本發(fā)明的EPSPS酶并使得該重組 宿主細胞獲得草甘膦耐受性。或者不通過載體轉化，而是直接將本發(fā)明的分離的核酸序 列，或本發(fā)明的核酸構建體用常規(guī)方法，如電穿孔等導入宿主細胞，同樣可以表達本發(fā)明的 EPSPS酶并賦予該細胞草甘膦耐受性。如此所獲得的載體和重組宿主細胞，以及獲得該細胞 的方法，都包括在本發(fā)明的范圍之內。
[0024] 本發(fā)明所提供的對植物進行改造的方法是：利用序列表中SEQ ID No:2所示的或 與其具有同源性的基因或對該基因序列進行植物密碼子優(yōu)化的基因轉化植物細胞，再將轉 化后的植物細胞培育成相應植株，從而使這些轉基因植物獲得抗草甘膦的能力。植物可選 大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、小麥、大麥、高粱、馬鈴薯、甘藍、白菜和青椒等。
[0025] 本發(fā)明涉及了常用草甘膦耐受性的選擇性標記基因篩選轉化的植物細胞或