cTnⅠ主要表位區(qū)的重組表達(dá)及其抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及人肌鈣蛋白I(CTnI)的三個(gè)主要表位區(qū)的重組表達(dá)及其相應(yīng)抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]急性心肌梗塞(AMI)是臨床常見(jiàn)急性多發(fā)病，是威脅人類(lèi)生命的主要疾病之一。在AMI生化診斷指標(biāo)方面，肌酸激酶同工酶(CK-MB)—度被認(rèn)為是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但CK-MB非心臟特有，非心臟手術(shù)或骨骼肌損傷病人也常出現(xiàn)CK-MB增高，造成AMI診斷假陽(yáng)性。近年來(lái)的研究表明，人心肌肌I丐蛋白I(cardiac troponinl，cTnl)具有高度心肌特異性，當(dāng)心肌細(xì)胞受損時(shí)，血液中的cTnl出現(xiàn)時(shí)間早，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，與心肌損傷程度及預(yù)后密切相關(guān)，可作為心肌損傷診斷的一項(xiàng)特異性指標(biāo)，正逐步取代CK-MB成為判斷心肌損傷的新的特異性標(biāo)準(zhǔn)物。
[0003]肌鈣蛋白(Troponin，Tn)由肌鈣蛋白I(TnI)、肌鈣蛋白C(TnC)和肌鈣蛋白T(TnT)三個(gè)亞單位組成。TnI有三種亞型:快型骨骼肌亞型，慢型骨骼肌亞型和心肌亞型。心肌肌鈣蛋白I(cTnl)在心肌組織中表達(dá)，在骨骼肌中不表達(dá)，具有心肌的高度特異性。正常情況下cTnl與TnT和TnC結(jié)合，以三元復(fù)合物的形式存在，AMI后cTnl釋放入血，其在血清中大部分以復(fù)合物的形式存在，其中4.1%為游離型，還可能以氧化型、還原型、磷酸化、去磷酸化及蛋白降解片段等多種形式存在。
[0004]cTnl共有210個(gè)氨基酸，含2個(gè)半胱氨酸，原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的重組蛋白均為包涵體，較難復(fù)性，且復(fù)性后的蛋白易被蛋白酶降解，難以保存。目前cTnl蛋白主要從人心肌組織提取，來(lái)源有限，成本昂貴，很難大量制備，所以表達(dá)高免疫原性的人cTnl蛋白，并制備其特異性抗體具有很好的市場(chǎng)前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開(kāi)了一種cTnl主要表位區(qū)的重組表達(dá)方法。根據(jù)cTnl表位圖譜和蛋白結(jié)構(gòu)，本發(fā)明選取了位于cTnl的N端、C端和中間穩(wěn)定區(qū)的三個(gè)表位區(qū)，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中均獲得可溶性表達(dá)。本發(fā)明還公開(kāi)了使用三種重組蛋白制備cTnl單克隆抗體、多抗血清的方法。
【附圖說(shuō)明】
[0006]
圖1是本發(fā)明制備人CTnI主要表位區(qū)重組蛋白的流程示意圖；
圖2是本發(fā)明制備重組cTnI主要表位區(qū)的SDS-PAGE電泳圖:
1、Ni2+螯合親和柱純化cTnl-N融合蛋白；
2、Ni2+螯合親和柱純化cTnl-S融合蛋白；
3、附2+螯合親和柱純化(^111-(:融合蛋白； 4、酶切純化后cTnl-N蛋白；
5、酶切純化后cTnl-S蛋白；
6、酶切純化后cTnl-C蛋白；
7、TF蛋白;
圖3是使用本發(fā)明的方法獲得的重組cTn1-N、cTn1-S和cTnl-C蛋白免疫原性的檢測(cè)；
圖4是使用本發(fā)明的方法獲得的重組蛋白cTn1-N、cTn1-S和cTnl-C偶聯(lián)載體蛋白后，免疫兔子，對(duì)所制備的多抗血清進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)；
圖5是使用本發(fā)明的方法獲得的重組蛋白cTn1-N、cTn1-S和cTnl-C免疫小鼠，對(duì)所制備單抗腹水進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0007]實(shí)施例l:cTnI_N編碼序列的擴(kuò)增
cTnl-N包含了全長(zhǎng)cTnIN端的特征性表位區(qū)。使用PCR方法從質(zhì)粒pUC57-cTnI (由南京金斯瑞公司合成cTnl編碼序列所構(gòu)建的重組質(zhì)粒)擴(kuò)增出cTnIN端1-79位氨基酸的編碼序列，所用的引物N5的5 ’端添加了NdeI的酶切位點(diǎn)，引物N3的3 ’端添加了XbaI的酶切位點(diǎn)cTnN5:5’-aagcatatggccgatggttcttccgatg-3’cTnN3: 5’-aagtctagagcaacgcgtgctcagtgc-3 ’
100 μ?的PCR反應(yīng)體系中加入I μ?的Vent DNA聚合酶(NEB)，20ymol/L的cTnN5和cTnN3各2yl，2.5mmol/L的dNTP加入8yl，10XPCR反應(yīng)緩沖液加入10yl，PCR的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，55 V退火30秒，72°C延伸50秒，然后回到預(yù)變性，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后延伸7分鐘。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離出PCR產(chǎn)物中的目的條帶，然后將目的條帶切下、純化。
[0008]實(shí)施例2: cTnl-S編碼序列的擴(kuò)增
cTnl-S是指cTnl序列中部的穩(wěn)定區(qū)。使用PCR方法從質(zhì)粒PUC57-cTnI (由南京金斯瑞公司合成cTnl編碼序列所構(gòu)建質(zhì)粒)擴(kuò)增出cTnl穩(wěn)定區(qū)28-110位氨基酸的編碼序列，所用的引物cTnS5的5 ’端添加了NdeI的酶切位點(diǎn)，引物cTnS3的3 ’端添加了XbaI的酶切位點(diǎn)cTnS5:5’-aagcatatggcgtatgccaccgaaccg-3’cTnS3: 5’-aagtctagattcttcgtcaactttatccacgcg-3’
100 μ?的PCR反應(yīng)體系中加入I μ?的Vent DNA聚合酶(NEB)，20ymol/L的cTnS5和cTnS3各2yl，2.5mmol/L的dNTP加入8yl，10XPCR反應(yīng)緩沖液加入10yl，PCR的反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，55 V退火30秒，72°C延伸50秒，然后回到預(yù)變性，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后延伸7分鐘。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物中的目的條帶，然后將目的條帶切下、純化。
[0009]實(shí)施例3:cTnI_C編碼序列的擴(kuò)增
cTnl-C包含了全長(zhǎng)cTnIC端區(qū)域的序列。使用PCR方法從質(zhì)粒pUC57-cTnI (由南京金斯瑞公司合成cTnl編碼序列所構(gòu)建質(zhì)粒)擴(kuò)增出cTnIC端150-210位氨基酸的編碼序列，所用的引物C5的5 ’端添加了NdeI的酶切位點(diǎn)，引物N3的3 ’端添加了XbaI的酶切位點(diǎn)cTnC5:5’-aagcatatggcggatgccatgatgcag-3’cTnC3: 5’-aagtctagacgattcaaatttctttttacgacc-3 ’ 100 μ?的PCR反應(yīng)體系中加入I μ?的Vent DNA聚合酶(NEB)，20 ymol/L的cTnC5和cTnC3各2 μ1，2.5 mmol/L的dNTP加入8 μ?，10 XPCR反應(yīng)緩沖液加入10 μ?，PCR的反應(yīng)條件為:94 °C預(yù)變性5分鐘，94 0C變性30秒，53 °C退火30秒，72 °C延伸40秒，然后回到預(yù)變性，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)，最后延伸7分鐘。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物中的目的條帶，然后將目的條帶切下、純化。
[0010]實(shí)施例4:重組cTn1-N、cTn1-S和CTn1-C融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建
分別取3 yg cTn1-N、cTn1-S和cTnl-C編碼序列的PCR回收產(chǎn)物，分別建立50μ1的雙酶切體系，具體如下:3yg的PCR回收產(chǎn)物，5μ1 1X !'酶切反應(yīng)緩沖液，1.5μ1 NdeI和1.5μ1XbaI，加雙蒸水至總體積50μ1，37°C水浴中反應(yīng)6小時(shí)。使用凝膠回收試劑盒(OMEGA B1-TEK)進(jìn)行回收。
[0011]取600ng的pCold? Ti7DNA(Takara)，建立50 μ?的雙酶切體系，具體如下:600ng的?(:01(^巧?0嫩質(zhì)粒，541的10\1'酶切反應(yīng)緩沖液，1.SylNdeMPl.5μ1 XbaI，加雙蒸水至總體積50μ1，37°C水浴中反應(yīng)6小時(shí)，核酸凝膠電泳，切膠，使用凝膠回收試劑盒(OMEGA B1-TEK)純化pCold?TF DNA質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物。
[0012]連接反應(yīng):取4 口1經(jīng)過(guò)純化的？(:01(^巧？ DNA的NdeI和XbaI雙酶切產(chǎn)物，