使用基因組編輯技術(shù)CRISPR-Cas9誘導(dǎo)CCR5Δ32缺失的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種新的基因組編輯技術(shù)CRISPR-Cas9誘導(dǎo)CCR5 Δ 32缺失的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 由人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)或稱艾滋病病毒引 起的艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)在全球已經(jīng)流行了30多年。艾 滋病屬于烈性傳染病，HIV病毒可以直接攻擊人體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致人體免疫機(jī)能缺陷，最終 因各種機(jī)會(huì)性感染和腫瘤導(dǎo)致患者死亡。HIV主要分成2個(gè)型，HIV-1和HIV-2型。在全球引起 艾滋病的主要是HIV-l，HIV-2僅限于非洲部分地區(qū)和其他地區(qū)的散在報(bào)道。據(jù)世界衛(wèi)生組 織(World Health 0rganization，WH0)報(bào)道，截止2013年底，全世界約有3500萬(wàn)HIV-1存活 感染者，另有大約3000萬(wàn)人已經(jīng)死亡，總計(jì)大約6500萬(wàn)人。2013年新發(fā)HIV-1感染者約為210 萬(wàn)，當(dāng)年死于艾滋病的病人約為150萬(wàn)(http: //www.who . int)。迄今為止，依然沒(méi)有有效的 抗艾滋病疫苗。雖然抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物以及抗病毒療法(antiretroviral therapy，ART)已 經(jīng)取得很大的進(jìn)展，能夠有效控制病毒的復(fù)制，但依然不能徹底清除病人體內(nèi)的HIV病毒， 不能從根本上治愈艾滋病，并且由于抗逆轉(zhuǎn)錄療法所需周期長(zhǎng)，給病人家庭也帶來(lái)了巨大 的精神壓力和經(jīng)濟(jì)壓力。
[0003] 我國(guó)也同樣經(jīng)歷了艾滋病的打擊。早在1989年，一例血友病患者因輸血感染艾滋 病。九十年代，云南吸毒人群艾滋病爆發(fā)流行。進(jìn)入二十一世紀(jì)，我國(guó)艾滋病的流行逐漸從 采供血人群、吸毒人群向性傳播人群轉(zhuǎn)變，包括同性戀和異性戀傳播。據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部和聯(lián)合 國(guó)艾滋病規(guī)劃署報(bào)道，截至2011年底，估計(jì)中國(guó)存活HIV-1感染者和艾滋病病人78萬(wàn)人(62 ~94萬(wàn)人），女性占28.6%;艾滋病(AIDS)病人15.4萬(wàn)人（14.6~16.2萬(wàn)人）；全人群感染率 為0· 058% (0.046 %~0.070 %)。估計(jì)2011年當(dāng)年新發(fā)HIV-1感染者4.8萬(wàn)人（4.1~5.4萬(wàn) 人），2011年艾滋病相關(guān)死亡2.8萬(wàn)人(2.5~3.1萬(wàn)人）。同樣，中國(guó)的艾滋病流行情況也不容 樂(lè)觀。
[0004] HIV病毒主要攻擊人的免疫系統(tǒng)，首先通過(guò)識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面的CD4受體(CD是 (Cluster of Different iation的縮寫(xiě)）是位于細(xì)胞膜表面一類分化抗原的總稱，CD后的序 號(hào)代表一個(gè)或一類分化抗原分子）<=CD4是HIV感染所必須的，在后續(xù)過(guò)程中HIV病毒分子還 需要與輔助受體相互作用，輔助受體主要為趨化因子受體CCR5(C-C Chemokine receptor type 5)和CXCR4(C_X_C chemokine receptor type 4)受體。HIV病毒成功結(jié)合受體蛋白和 輔助受體蛋白后，導(dǎo)致病毒的包膜和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而發(fā)生融合，病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi) 部。CCR5是一個(gè)7次跨膜蛋白（如圖1)，含有352個(gè)氨基酸，是細(xì)胞表面的一種正常的趨化因 子受體，同時(shí)也是HIV進(jìn)入靶細(xì)胞CD4陽(yáng)性細(xì)胞的主要輔助受體。人們發(fā)現(xiàn)，在歐洲高加索人 中存在著一些可以抵抗HIV病毒的人，測(cè)序表明，在這些人中正常的CCR5基因突變成了CCR5 Δ 32基因。CCR5 Δ 32缺失為CCR5基因編碼區(qū)第794-825位的32個(gè)堿基的缺失（如圖2)，使其 185位后的氨基酸發(fā)生改變，導(dǎo)致翻譯提前終止，產(chǎn)生了一種僅有215個(gè)氨基酸的缺失蛋白， 這種缺失蛋白由于喪失了 5、6、7三個(gè)跨膜區(qū)域，不能正常定位于細(xì)胞膜上，只能停留在內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)中。擁有這種突變的細(xì)胞由于缺少了能與病毒融合所需要的輔助受體，使其具有了能夠 抵抗HIV的能力。若細(xì)胞內(nèi)的CCR5雙等位基因都帶有△ 32缺失，則該細(xì)胞為純合子，記作 CCR5 Δ 32/ Δ 32;若僅有一個(gè)Δ 32缺失突變，另一個(gè)為野生型，則為雜合子，記作CCR5 Δ 32/ WT。研究表明，CCR5 Δ 32/Δ 32純合子缺失對(duì)HIV具有天然抗性，不能感染HIV病毒；CCR5 Δ 32/WT雜合子缺失，可以延長(zhǎng)艾滋病的發(fā)病期。
[0005] 2009年，德國(guó)醫(yī)生報(bào)道，柏林的一位HIV感染者叫Timothy Brown,在診斷為HIV感 染10年，并接受抗病毒治療4年以后，診斷出患有急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia)。醫(yī)生為他進(jìn)行了異體干細(xì)胞移植，干細(xì)胞移植的供者是CCR5 △ 32/△ 32純合子。 患者在停止抗病毒治療20個(gè)月，接受了兩次干細(xì)胞移植后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病毒的反彈。更重要的 是，停藥7年以后，依然沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病毒反彈。這是世界上第一個(gè)被認(rèn)為是治愈的HIV感染者， 或者稱為功能性治愈，即停止抗病毒治療后，沒(méi)有病毒反彈。
[0006] 調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CCR5 Δ 32/ Δ 32缺失純合子在歐洲高加索人群中稍高(4-10% )，但是在 非洲和亞洲人群中很少存在，中國(guó)人中只有0 - 0.19%。在中國(guó)，由于供者的稀少，以及存在 異體移植的排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，試圖尋找CCR5 △ 32/ △ 32缺失的供者進(jìn)行骨髓移植，復(fù)制柏林 病人是不現(xiàn)實(shí)的。本發(fā)明試圖使用新的方法完成這一任務(wù)。
[0007] HIV病毒基因組為核糖核酸RNA，因帶有逆轉(zhuǎn)錄酶，分類上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科、慢病 毒屬。這一屬的病毒致病，需要很長(zhǎng)的潛伏期，緩慢發(fā)病，因此稱為慢病毒。慢病毒載體是以 HIV-1為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的基因治療載體，去除了HIV-1的致病基因，模擬病毒感染細(xì)胞的過(guò) 程，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，適用于較難轉(zhuǎn)染外源基因的細(xì)胞，如淋巴 細(xì)胞、原代細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞等。該載體可以將外源基因有效地整合在宿主細(xì)胞的 基因組中，從而達(dá)到長(zhǎng)時(shí)間、穩(wěn)定地表達(dá)外源基因。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，需要將攜帶外源基因的 目的質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞中，以此來(lái)產(chǎn)生慢病毒顆粒，包裝好的假病毒 顆粒會(huì)分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中，離心取得上清液后，直接用于宿主細(xì)胞的感染，包裝好的 慢病毒顆粒感染宿主細(xì)胞后，目的質(zhì)粒會(huì)在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在整合酶的 作用下隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組中，使得目的基因在宿主細(xì)胞中可以穩(wěn)定長(zhǎng)期表達(dá)。
[0008] 最近，一種新的基因組編輯技術(shù)一一成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相 關(guān)蛋白CRISPR-Cas技術(shù)[clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)and CRISPR associated protein(Cas)]日益受到重視并得到廣泛應(yīng)用。CRISPR 序列普遍存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中，是在不斷進(jìn)化的過(guò)程中形成的一種細(xì)菌對(duì)抗細(xì)菌的病毒 --噬菌體進(jìn)攻的免疫防御系統(tǒng)。CRISPR位點(diǎn)通常由短的高度保守的重復(fù)序列(repeats) 組成，重復(fù)序列之間由不同長(zhǎng)度的間隔序列（spacer)所隔開(kāi)，間隔序列一般被認(rèn)為來(lái)源于 噬菌體或外源DNA序列，類似于免疫記憶，當(dāng)具有同樣基因序列的外源DNA再次侵染細(xì)胞時(shí)， 該間隔序列就可以識(shí)別并與外源序列結(jié)合，然后在一系列相關(guān)蛋白的作用下將外源序列進(jìn) 行切割，以此達(dá)到保護(hù)自身的目的。CRISPR系統(tǒng)根據(jù)參與防御過(guò)程的Cas蛋白的不同，可分 為三種類型。其中Π 型CRISPR系統(tǒng)由于其簡(jiǎn)單性應(yīng)用范圍更加廣泛，它僅需要一種Cas9蛋 白就可以完成整個(gè)外源基因序列的切割過(guò)程。自然情況下II型CRISPR系統(tǒng)還需要crRNA (CRISPR RNA)和transcrRNA(trans_activating crRNA)來(lái)共同引導(dǎo)Cas9對(duì)外源基因序列 的識(shí)別及切割，為了簡(jiǎn)化這一系統(tǒng)，目前較為普遍使用的是crRNA和transcrRNA兩者的融合 體--引導(dǎo)RNA(guide RNA，gRNA)來(lái)幫助Cas9蛋白識(shí)別目標(biāo)序列。CRISPR-Cas9技術(shù)通過(guò) gRNA識(shí)別原型間隔序列峨鄰基序(protospacer adjacent motif,ΡΑΜ)位點(diǎn)與目標(biāo)序列結(jié) 合，在核酸酶Cas9的作用下，將目標(biāo)位點(diǎn)處的雙鏈DNA進(jìn)行切割，導(dǎo)致雙鏈斷裂，從而誘發(fā)細(xì) 胞的自我修復(fù)過(guò)程，細(xì)胞可以通過(guò)兩種方式進(jìn)行修復(fù)一一同源重組或非同源末端連接，通 過(guò)這兩種修復(fù)途徑可以產(chǎn)生特異性的基因修飾或造成少數(shù)核苷酸殘基的缺失插入突變，從 而導(dǎo)致了目標(biāo)序列的基因發(fā)生突變。
[0009]已有一些報(bào)道使用該技術(shù)破壞CCR5整個(gè)基因，但是如果破壞CCR5的整個(gè)基因，其 潛在的危害未知。而CCR5A 32缺失在人群中已經(jīng)存在，突變者可以健康地存活，沒(méi)有見(jiàn)到任 何異常。因此，誘導(dǎo)CCR5A 32缺失更有意義。
[0010]本發(fā)明利用慢病毒包裝系統(tǒng)在淋巴細(xì)胞中成功表達(dá)CRISPR-Cas9,成功獲得了基 因型為CCR5 △ 32/△ 32純合的單克隆細(xì)胞，為人們?cè)诨蛩街委煱滩∩咸峁┝诵碌乃?路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明目的是解決人工誘導(dǎo)CCR5A 32缺失的問(wèn)題，提供一種使用基因組編輯技術(shù) CRISPR-Cas9誘導(dǎo)HIV病毒輔助受體CCR5 Δ 32/Δ 32缺失的方法，從而為可能的治愈艾滋病 提供一種藥物。
[0012] 本發(fā)明的技術(shù)方案
[0013] 使用基因組編輯技術(shù)CRISPR_Cas9誘導(dǎo)CCR5A 32缺失的方法，該方法使用了基因 組編輯技術(shù)CRISPR-Cas9技術(shù)，成功誘導(dǎo)了CCR5 Δ 32缺失，該方法的具體內(nèi)容包括：
[0014] 第一、引導(dǎo)RNA(gRNA)的設(shè)計(jì)
[0015] 為達(dá)到獲得CCR5 Δ 32/ Δ 32純合子細(xì)胞的目的，針對(duì)于CCR5 Δ 32兩側(cè)的目標(biāo)序列 設(shè)計(jì)一對(duì)gRNA，左側(cè)的目標(biāo)序列為gRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列，如SEQ ID No.l或者SEQ ID No.3-19中的任一個(gè)序列，右側(cè)的目標(biāo)序列為gRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列，如SEQ ID No. 2或者SEQ ID No. 20-36中的任一個(gè)序列;我們發(fā)現(xiàn)選取這兩個(gè)目標(biāo)序列后的Cas9核酸酶切割結(jié)果和天然 CCR5 Δ 32的缺失完全一樣(如圖2,箭頭所示為Cas9切割位點(diǎn)）。
[0016] 所述的目標(biāo)序列還可以是SEQIDNol.和SEQIDNo.20-36的任意組合；SEQID No2.和SEQIDNo.20-36的任意組合 ；……SEQIDNol9.和SEQIDNo.20-36的任意組合； 由于CRISPR-Cas9的容錯(cuò)性，個(gè)別堿基發(fā)生改變，也可以被識(shí)別，因此只要帶有種子DNA序列 "5'taatgtc 3'"和"5'gactgta 3'"的gRNA針對(duì)于CCR5 Δ 32缺失就在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。
[0017] 第二、根據(jù)第一步設(shè)計(jì)的gRNA，將對(duì)應(yīng)的DNA插入到CRISPR-Cas9載體質(zhì)粒中，構(gòu)建 功能質(zhì)粒，該質(zhì)粒具有以下特點(diǎn)：
[0018] ①該質(zhì)粒帶有核酸酶Cas9表達(dá)讀碼框、CRISPR其他相關(guān)基因序列和慢病毒包裝信 號(hào)，質(zhì)粒圖譜如圖3所示（質(zhì)粒載體lenti-CRISPR-v2來(lái)自于美國(guó)麻省理工學(xué)院的張峰實(shí)驗(yàn) 室）
[0019] ②針對(duì)CCR5 Δ 32位點(diǎn)兩端處的gRNA，gRNA序列如第一步所述；
[0020] 研究表明，對(duì)于同一處目標(biāo)序列來(lái)說(shuō)，不僅僅只有野生型的Cas9核酸酶才能發(fā)生 切割，對(duì)于一個(gè)目標(biāo)序列來(lái)說(shuō)，同時(shí)使用兩個(gè)Cas9切口酶(Cas9的突變體)也可進(jìn)行切割，所 以使用Cas9切口酶或者Cas9的