檢測K-ras基因突變的引物和探針體系、方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測K-ras基因突變的引物和探針 體系、方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] K-ras基因是EGFR信號通路中的重要分子之一，是首個影響結(jié)直腸癌臨床治療決 策的生物標(biāo)記物，其所編碼的K-ras蛋白為EGFR信號通路下游區(qū)的一種分子G蛋白，當(dāng)K-ras 基因發(fā)生突變后，會導(dǎo)致該信號通路異?；罨?，從而對EGFR單抗治療無效。因此，K-ras基因 狀態(tài)與針對EGFR的靶向藥物(例如西妥昔單抗和帕尼單抗等）的療效有關(guān)，《09年NCCN非小 細(xì)胞肺癌臨床實踐指南》明確指出：如果K-ras基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用特羅凱 (Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib)進(jìn)行分子革巴向治療。
[0003] 許多腫瘤中K-ras基因的突變率較高，在白血病、肺癌、直腸癌、胰腺癌等癌癥中， K-ras突變很常見，尤其是在結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌中，突變率甚至可達(dá)30~60%和21~ 28%。同時在上述兩種腫瘤中約80~90%的K-ras基因突變發(fā)生在突變熱點(diǎn)2號外顯子12、13 密碼子上，其中的7個突變熱點(diǎn)：612(：、6121?、6123、612￥、6120、6124、613￥/1)占到了全部突變 的90%以上。
[0004] 因此，檢測K-ras基因上述7個突變熱點(diǎn)，可準(zhǔn)確判斷患者對該類治療的預(yù)測療效， 以供臨床醫(yī)師參考，也能盡最大的努力篩選出有效人群，避免錯過治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述問題，本發(fā)明提供一種檢測人K-ras基因突變的引物和探針體系，可同時 檢測KRAS基因7種突變，最多可以檢測1~10拷貝的基因突變，特異性強(qiáng)，在10~30ng野生 型DNA背景下不受干擾，檢測性能突出，在10ng DNA背景下，可以檢測出1~10拷貝的基因突 變。
[0006] 為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)： 設(shè)計一種檢測K-ras基因突變的引物和探針體系，包括SEQ ID NO: 1~13所示的核苷酸 序列，所述引物或探針具有以下特點(diǎn)： (1) 本發(fā)明引進(jìn)LNA修飾的野生探針封閉野生模板，探針3'-末端用P04修飾或NH2修飾 封閉阻止Taq DNA聚合酶的延伸； (2) 本發(fā)明特異性引物3'-末端堿基采用LNA修飾； (3) 本發(fā)明特異性引物3'-末端起第二個堿基引入脫氧次黃嘌呤核苷修飾。
[0007] 設(shè)計一種檢測K-ras基因突變的方法，包括以下步驟： (1) 合成所述引物和探針； (2) 配置5(^1^熒光？0?反應(yīng)體系：81^€61(10\)5以1^，]\^2+1.0~5111111〇1/1，(1抑1 3100~ 1000nmol/L，上述每個引物100~500nmol/L，上述每個探針100~1000nmol/L，Taq DNA聚合 酶1U~3U，DNA模板5~10ng; (3) 進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增程序:酶激活，95°C lOmin;突變富集，95°C 30s，68°C 30,64°C 50s，72°C 25s，16個循環(huán)；擴(kuò)增檢測，30個循環(huán)，95°C 30s，58°C 32s，72°C 18s，于"58°C 32s"該步驟收集熒光信號FAM和HEX; (4) 結(jié)果判定:檢測體系中，HEX通道15〈Ct〈22，表明上樣在可控范圍內(nèi)，結(jié)果有效；以 FAM信號通道為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，曲線呈"S"曲線，且Ct〈29為陽性，Ct為0則為陰性。
[0008] 所述DNA模板包括FFPE組織及外周血游離DNA。
[0009] 利用上述引物和/或探針中的至少一種，可制成用于檢測K-ras基因突變的試劑 盒。
[0010] 本發(fā)明具有以下積極有益技術(shù)效果： (1)本發(fā)明改良現(xiàn)有擴(kuò)增受阻檢測體系，擯棄ARMS引物設(shè)計中引入錯配的原則，將特異 性檢測突變引物3'_末端起第2堿基采用脫氧次黃嘌呤核苷代替。脫氧次黃嘌呤核苷(dl)是 天然存在的堿基，與A、G、C、T結(jié)合力弱，當(dāng)與其它堿基結(jié)合時，會比其它堿基錯配相對更穩(wěn) 定。脫氧次黃嘌呤與其它堿基的結(jié)合能力為:dI:dC> dI:dA> dI:dG> dI:dT，在DNA聚合酶 的催化下，脫氧次黃嘌呤優(yōu)先與dC結(jié)合。
[0011] (2)本發(fā)明在特異性檢測突變引物的3'-末端堿基采用LNA修飾，提高了檢測的特 異性和敏感性。
[0012] (3)本發(fā)明引入了LNA修飾的封閉野生型的LNA探針，使得可以在高背景下檢測低 拷貝。
[0013] 因此，本發(fā)明可同時檢測KRAS基因7種突變;最多可以檢測1~10拷貝的基因突變； 特異性強(qiáng)，在10~30ng野生型DNA背景下不受干擾;檢測性能突出，在10ng DNA背景下，可 以檢測出1~10拷貝的基因突變。
【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)對照示意圖。
【具體實施方式】
[0015] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，對本 發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。以下實施例中所涉及的原料，如無特別說明均為市售，所涉及檢測方法如無特 別說明，則均為常規(guī)方法。
[0016] 實施例1 一種檢測KRAS基因7種突變的試劑盒，包括SEQ ID NO: 1~13所示的核苷酸序列，見表 1〇
[0017] 表1引物和探針
[0018」 買施例2
一種檢測K-ras基因7種突變的方法，包括以下步驟： (1) 配置50yL熒光PCR反應(yīng)體系：Buff er( 10 X )5yL，Mg2+ 2 · Ommol/L，dNTP 300nmol/L， 實施例1每個引物200nmol/L，實施例1每個探針300nmol/L，Taq DNA聚合酶2U，DNA模板 l0ng，余量為 ddH20; (2) 進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增程序:酶激活，95°C lOmin;突變富集，95°C 30s，68°C 30,64°C 50s，72°C 25s，16個循環(huán)；擴(kuò)增檢測，30個循環(huán)，95°C 30s，58°C 32s，72°C 18s，于"58°C 32s"該步驟收集熒光信號FAM和HEX; (3) 結(jié)果判定:檢測體系中，HEX通道15〈Ct〈22，表明上樣在可控范圍內(nèi)，結(jié)果有效；以 FAM信號通道為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，曲線呈"S"曲線，且Ct〈29為陽性，Ct為0則為陰性。
[0019] 實施例3 一、K_r a s突變檢測體系和閾值的確定 (1) 突變檢測體系:通過長期的反復(fù)測試研究，本發(fā)明確定K-ras檢測的上樣量為10ng， 將K-ras基因7種突變分別裝入八排管的7個孔，第8個為外控； (2) 陽性判定：陽性判定需要滿足以下要求： 首先，PCR陰性對照沒有擴(kuò)增曲線，有標(biāo)明有污染，結(jié)果不可靠； 其次，檢測1〇3 copies陽性突變，Ct〈23，否則性能不穩(wěn)定； 第三，外控的Ct值為：17~25，確保上樣量的準(zhǔn)確性； 最后，檢測樣品，曲線成"S"，且Ct〈30。
[0020] 滿足上述條件，待檢測樣品K-ras基因突變?yōu)殛栃浴?br>[0021] 結(jié)果無論有無突變，內(nèi)參HEX通路都有曲線可以觀察到，如果沒有，則表明實驗存 在錯誤，需要重新實驗，見圖1。
[0022]二、檢測結(jié)腸癌K-ras基因突變 62例結(jié)腸癌樣本，已經(jīng)采用廈門艾德ADX-ARMS試劑盒標(biāo)定，來評價本發(fā)明實施例2檢 測臨床樣本的準(zhǔn)確性。檢測有出入或陽性的樣本采用C0LD-PCR后，亞克隆測序鑒定。 表2本發(fā)明檢測與ADX-ARMS結(jié)果對比
通過與對62例臨床樣本的檢測，結(jié)果與廈門艾德完全一致，且主要為Glyl2Ser(GGT> AGT)、Glyl2Val(GGT>GTT)、Glyl2Asp(GGT>GAT)、Glyl2Ala(GGT>GCT)和Glyl3Asp(GGC> GAC)，具體的結(jié)果參加表2。對兩種方法檢測判定為陽性的樣本采用COLD-PCR測序，結(jié)果完 成正確。在結(jié)腸癌中，K-ras的突變率約為32.8%左右。
【主權(quán)項】
1. 一種檢測κ-ras基因突變的引物和探針體系，其特征在于:包括SEQ ID NO: 1~13所 示的核苷酸序列。2. -種檢測K-ras基因突變的方法，其特征在于:包括以下步驟： (1) 合成權(quán)利要求1所述引物和探針； (2) 配置50yL熒光PCR反應(yīng)體系：Buffer 5yL，Mg2+ 1.0~5mmol/L，dNTP 100~ 1000nmol/L，權(quán)利要求1中所述引物100~500nmol/L，權(quán)利要求1中所述探針100~ 1000nmol/L，Taq DNA聚合酶 1U~3U，DNA模板5~10ng; (3) 進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增程序：酶激活，95°C lOmin;突變富集，95°C 30s，68°C 30,64°C 50s，72°C 25s，16個循環(huán)；擴(kuò)增檢測，95°C 30s，58°C 32s，72°C 18s，30個循環(huán)，于"58°C 32s"該步驟收集熒光信號FAM和HEX; (4) 結(jié)果判定：檢測體系中，HEX通道15〈Ct〈22，表明上樣在可控范圍內(nèi)，結(jié)果有效；以 FAM信號通道為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，曲線呈"S"曲線，且Ct〈29為陽性，Ct為0則為陰性。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述檢測K-ras基因突變的方法，其特征在于:所述DNA模板包括FFPE 組織DNA或外周血游離DNA。4. 一種檢測K-ras基因突變的試劑盒，包括權(quán)利要求1所述引物和/或探針中的至少一 種。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測K<b>-</b>ras基因突變的引物和探針體系，包括SEQ？ID？NO：1～13所示的核苷酸序列；還公開了其檢測方法，包括配置50μL熒光PCR反應(yīng)體系、進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增程序、結(jié)果判定等步驟。本發(fā)明可同時檢測KRAS基因7種突變；最多可以檢測1～10拷貝的基因突變；特異性強(qiáng)，在10～30ng？野生型DNA背景下不受干擾；檢測性能突出，在10ng？DNA背景下，可以檢測出1～10拷貝的基因突變。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68
【公開號】CN105567837
【申請?zhí)枴緾N201610071654
【發(fā)明人】陳曉琦, 張傳雷, 王新亭, 張閃閃, 劉姝, 陳欣菊, 冀愛英, 劉香麗, 張宇
【申請人】河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年2月2日