用于定量檢測rprm基因dna甲基化試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明的屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于定量檢測RPRM基因 DNA甲基化試劑盒 及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA甲基化作為最基本的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制，是腫瘤中最常見的基因分子改變 之一，尤其表現(xiàn)在腫瘤抑制基因與錯配修復(fù)基因上，能導(dǎo)致基因編碼區(qū)的突變和使基因失 活而有利于腫瘤的發(fā)展，是癌癥發(fā)生的重要指標(biāo)之一。人類不同類型的癌癥基因甲基化模 式圖譜的建立是相關(guān)領(lǐng)域研究的一項重要內(nèi)容。目前已在肺癌、胃癌、頭部和頸部癌癥、膀 胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、和膽囊癌等中發(fā)現(xiàn)基因的異常甲基化。
[0003] RPRM基因的全稱：reprimo, TP53 dependent G2 arrest mediator candidate， 是一種p53腫瘤抑制因子誘導(dǎo)表達的基因，位于染色體2q23位點上，該位點等位基因失衡已 被證明與肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌等相關(guān)聯(lián)。在許多癌癥和腫瘤細胞株的檢測中，都發(fā)現(xiàn)了 RPRM基因的異常甲基化，包括胃癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、大腸癌、食道癌、膽囊癌、淋巴 瘤、白血病、乳腺癌患者。特別是在早期胃癌的血漿樣品檢測中，只有RPRM有高甲基化頻率 (> 70%)，而正常的對照血漿無明顯的經(jīng)常性甲基化，說明發(fā)現(xiàn)于癌癥的RPRM甲基化，很少 發(fā)生在非惡性的組織中。因此，RPRM甲基化作為胃癌早期血清學(xué)活檢的生物標(biāo)志物是有潛 力的。另一方面，胃癌患者RPRM甲基化檢測并與胃黏膜萎縮標(biāo)記和幽門螺桿菌檢測相結(jié)合 有可能建立起胃癌早期檢測的指標(biāo)。此外，由于RPRM甲基化是胃癌患者的重要指標(biāo)之一，有 可能用于胃癌的預(yù)后檢測中。目前RPRM甲基化檢測已在美國被批準(zhǔn)進入臨床試驗階段。因 此，RPRM基因甲基化，作為癌癥診治中重要的血清分子標(biāo)志物，可以作為診斷和治療中的一 項重要參考依據(jù)。
[0004] 基因甲基化主要發(fā)生于CpG位點的C(即胞嘧啶）上，在重亞硫酸鹽的作用下，胞嘧 啶將轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持不變，再進一步通過DNA測序分析等方法，區(qū) 別胞密啶及尿密啶。因此，通過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化可以區(qū)別胞嘧啶的甲基化或者非甲基化。本 發(fā)明，改進了重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法，并通過建立甲基化修飾及非修飾內(nèi)參質(zhì)粒，配合實時 PCR的方法及閾值截取，將重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化PCR方法加以優(yōu)化，進行DNA甲基化敏感的熔解曲 線分析，達到對DNA甲基化進行定量檢測的目的。該方法不僅可用于定量檢測RPRM基因 DNA 甲基化，也可用于定量檢測其他基因 DNA甲基化，且免除了 DNA測序的步驟，而且對甲基化的 程度可以加以定量分析，操作較為簡便，成本較低，非常適合于未來大量樣本的高通量分 析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供用于定量檢測RPRM基因 DNA甲基化試劑盒及方法，該方法 不僅可用于定量檢測RPRM基因 DNA甲基化，也可用于定量檢測其他基因 DNA甲基化，且免除 了 DNA測序的步驟，而且對甲基化的程度可以加以定量分析，操作較為簡便，成本較低，非常 適合于未來大量樣本的高通量分析。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 用于定量檢測RPRM基因 DNA甲基化試劑盒，包含:DNA轉(zhuǎn)化試劑組分(重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化反 應(yīng)液），DNA純化試劑組分(玻璃纖維膜離心柱，結(jié)合緩沖液，漂洗緩沖液、脫硫緩沖液，洗脫 緩沖液），甲基化檢測試劑組分（2 X SYBR GREEN I預(yù)混反應(yīng)液，引物RPRM-F與RPRM-R，甲基 化陽性對照質(zhì)粒SM及非甲基化陽性對照質(zhì)粒Su)。
[0007] 用于定量檢測RPRM基因 DNA甲基化的方法，所述方法包括如下： (1)在0.2毫升的PCR管中，加入含有1納克至1微克DNA的20微升DNA水溶液，然后加入 80微升重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化反應(yīng)液，進行DNA轉(zhuǎn)化反應(yīng);將上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)后100微升的DNA溶液， 進行如下純化處理。
[0008] (2)將上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)后100微升溶液，與500微升結(jié)合緩沖液進行混合，通過玻璃纖 維膜離心柱收集轉(zhuǎn)化后的DNA，并用漂洗緩沖液進行清洗;離心棄去漂洗緩沖液，加入脫硫 緩沖液進行脫硫處理，用漂洗緩沖液再清洗兩次;離心棄去漂洗緩沖液，然后用30微升洗脫 緩沖液收集玻璃纖維膜離心柱上經(jīng)處理后的DNA。
[0009] (3)取上述純化后的DNA溶液1微升轉(zhuǎn)移到0.1毫升的PCR管中，在含1 XSYBR GREEN I預(yù)混反應(yīng)液，0.25微摩爾/升RPRM-F、RPRM-R引物的反應(yīng)液中進行實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴 增;條件如下：擴增階段:95°C、30秒；[95°C、5秒，56°C、15秒，72°C、30秒]40個循環(huán);熔解 曲線階段:95°C、15秒，然后從72°C_88°C每升高0.1°C讀取一次熒光值，將得到的結(jié)果進行 熔解曲線法分析，以確定樣本中RPRM基因啟動子特異DNA序列甲基化的程度。
[0010]步驟(3)中的熔解曲線法分析使用兩種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為參照：甲基化的RPRM基因序 列經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后的M-seq，序列為SEQ ID NO. 2，而非甲基化序列轉(zhuǎn)化后U-seq，序列 為SEQ ID N0.3,然后分別將這兩種序列克隆至載體上作為陽性對照標(biāo)準(zhǔn)樣品SM和Su，進行 上述(3)所描述的實時PCR擴增及熔解曲線分析。
[0011] 具體為： 用于定量檢測RPRM基因 DNA甲基化試劑盒，包含:DNA轉(zhuǎn)化試劑組分(重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化反 應(yīng)液），DNA純化試劑組分(玻璃纖維膜離心柱，結(jié)合緩沖液，漂洗緩沖液、脫硫緩沖液，洗脫 緩沖液），甲基化檢測試劑組分（2 X SYBR GREEN I預(yù)混反應(yīng)液，引物RPRM-F與RPRM-R，甲基 化陽性對照質(zhì)粒SM及非甲基化陽性對照質(zhì)粒SU)。
[0012] 所述DNA轉(zhuǎn)化試劑組分中，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化反應(yīng)液含5摩爾/升NaHS03，12.5wt.% 乙二醇二甲醚(DME)，pH 5.0。
[0013] 所述DNA純化試劑組分中，結(jié)合緩沖液含6摩爾/升鹽酸胍;漂洗緩沖液含10毫摩 爾/升Tris-Cl，pH 6.8,體積分數(shù)80%乙醇;脫硫緩沖液含200毫摩爾/升NaOH，100毫摩爾/升 NaCl，體積分數(shù)30%乙醇，體積分數(shù)5%甘油;洗脫緩沖液含10毫摩爾/升Tris-Cl，1毫摩爾/升 EDTA，pH 8.0。
[0014] 所述的引物RPRM-F為：5 ' -GTTTTAGAAGAGTTTAGTTGTTG-3 ' ； RPRM-R為5 ' -CTACTATTAACCAAAAACAAAC-3,〇
[0015] 所述的2XSYBRGREENI預(yù)混反應(yīng)液含有2毫摩爾/升MgC12、100毫摩爾/升Tris-Cl，l個酶活力單位/微升Taq DNA聚合酶，5毫摩爾/升dNTPs，2XSYBR GREEN I染料和2X ROX I校準(zhǔn)染料。其中2XSYBR GREEN I染料、2XR0X I校準(zhǔn)染料購買自北京博凌科為生物 科技有限公司。
[0016]用于定量檢測RPRM基因 DNA甲基化的方法，包括如下： (1 )DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化反應(yīng)： 在0.2毫升的PCR管中，加入含有1納克至1微克DNA的20微升DNA水溶液，然后與80微升 轉(zhuǎn)化反應(yīng)液混勻;將PCR管置于熱循環(huán)儀中進行如下反應(yīng)：95°C 3分鐘預(yù)變性；[95°C 30 秒，70°C 10分鐘]12個循環(huán)。
[0017] (2)DNA 純化處理： 將上述轉(zhuǎn)化反應(yīng)后100微升溶液，與500微升結(jié)合緩沖液進行混合，然后全部轉(zhuǎn)移至玻 璃纖維膜離心柱中，12000轉(zhuǎn)/秒轉(zhuǎn)速離心1分鐘；棄去流出液，加入500微升漂洗緩沖液， 12000轉(zhuǎn)/秒轉(zhuǎn)速離心1分鐘；棄去流出液，加入250微升脫硫緩沖液，室溫放置10分鐘，12000 轉(zhuǎn)/秒轉(zhuǎn)速離心1分鐘；棄去流出液，加入500微升漂洗緩沖液，12000轉(zhuǎn)/秒轉(zhuǎn)速離心1分鐘， 然后再重復(fù)此步驟一次；12000轉(zhuǎn)/秒轉(zhuǎn)速離心2分鐘徹底甩去殘留的漂洗緩沖液，然后將離 心柱轉(zhuǎn)移至新的1.5毫升Eppendorf管中；加30微升洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，然后12000 轉(zhuǎn)/秒轉(zhuǎn)速離心1分鐘收集純化后的DNA。
[0018] (3)PCR反應(yīng)及MS-MCA(Methylation_sensitive Melt Curve Analysis)分析： 在0.1毫升的熒光定量PCR管中，加入8微升超純水，10微升2XSYBR GREEN I預(yù)混反應(yīng) 液，濃度為10微摩爾/升RPRM-F和RPRM-R引物各0.5微升，最后加入1微升上述純化的DNA，混 勾。然后將PCR管置于熒光定量PCR儀中進行如下反應(yīng)：擴增階段:95°C 30秒預(yù)變性；[95 °C 5秒，56°C 15秒，72°C 30秒]共40個循環(huán);熔解曲線階段:95°C 15秒預(yù)變性，然后從72 °C_88 °C每升高0.1 °C讀取一次熒光值，將得到的結(jié)果進行熔解曲線法分析，以確定樣本 中RPRM基因啟動子特異DNA序列甲基化的程度。
[0019] ⑷陽性對照： 在上述(3)的分析中，需要在另外的熒光定量PCR管中使用兩種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒Sm和Su作為參 照。人基因組RPRM祀基因序列（SEQ ID No.l，Ref-seq)，完全甲基化的基因組DNA經(jīng)重亞硫 酸鹽轉(zhuǎn)化后相應(yīng)的序列（SEQ ID No.2, M-seq)，以及非甲基化的基因組轉(zhuǎn)化后相應(yīng)的序列 (SEQ ID No.3, U-seq)如下： SEQ ID No.l, Ref-seq： gctttagaagagcctagctgctgcgcgcgtcggagaggctcctgggaaactcccacggcccagggactttcga aagcagagcgaggagccctcgcacgcgctagtctgcgagtgagcgctcagcccggcacctgttcctccagcgccgcc gccttcccacccctcggacccgcgccgctcgcggcgcccgcccgttcctgcgatgaatccggccctaggcaaccaga cggacgtggcgggcctgttcctggccaacagcag SEQ ID No.2， M_seq，SM: gttttagaagagtttagttgttgcgcgcgtcggagaggtttttgggaaatttttacggtttagggattttcga aagtagagcgaggagttttcgtacgcgttagtttgcgagtgagcgtttagttcggtatttgtttttttagcgtcgtc gtttttttatttttcggattcgcgtcgttcgcggcgttcgttcgtttttgcgatgaattcggttttaggtaattaga cggacgtggcgggtttgtttttgg