食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌lamp檢測(cè)引物及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全的分子生物學(xué)檢測(cè)方法領(lǐng)域，涉及食品中單核細(xì)胞增生李斯 特氏菌的LAMP檢測(cè)專用引物及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] -直以來，食源性細(xì)菌中毒事件在我國乃至世界范圍內(nèi)頻繁發(fā)生，對(duì)人類健康、社 會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成很大的威脅。其中由單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes) 引起的食源性細(xì)菌中毒事件逐漸引起人們的重視。單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌最早是 Murray等人于1926年在英國從家兔和豚鼠體內(nèi)分離得到的，因?yàn)榻臃N此菌的家兔發(fā)生明顯 的單核細(xì)胞增多，故因此得名。單增李斯特菌在自然界中分布廣泛，并可以寄生在生物體 內(nèi)，人畜感染后，主要表現(xiàn)為腦膜炎、敗血癥和血液中單核細(xì)胞增多等癥狀，死亡率高達(dá)so-so% ，對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展造成了十分嚴(yán)重的危害，對(duì)人和動(dòng)物的生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅， 被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為20世紀(jì)90年代食品中四大致病菌之一。
[0003] 目前對(duì)該菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)分離鑒定方法、免疫學(xué)方法和PCR方法。三種方 法各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中傳統(tǒng)分離鑒定方法準(zhǔn)確性較高，但檢測(cè)周期長，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè) 需求;免疫學(xué)檢測(cè)周期短，但靈敏度較差;PCR的方法檢測(cè)時(shí)間短、靈敏性高，但對(duì)儀器設(shè)備 要求較高。研究新的快速、準(zhǔn)確，操作簡便的單增李斯特氏菌檢測(cè)方法，具有重要的現(xiàn)實(shí)意 義。
[0004] 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，簡稱LAMP)， 是2000年由日本的榮研株式會(huì)的Notomi T等人開發(fā)出來的一種新的核酸擴(kuò)增方法。LAMP法 是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異的引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶（Bst DNApolymerase)在恒溫條件(65°C左右)保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，具有高特 異性和等溫快速擴(kuò)增的特點(diǎn)。本文通過優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，建立單增李斯特菌LAMP檢測(cè)方 法，并將其應(yīng)用于冷鮮肉中單增李斯特菌快速檢測(cè)。
[0005] 單核細(xì)胞增生李斯特菌作為食品衛(wèi)檢驗(yàn)中一項(xiàng)重要的目的菌，提高其檢出限、縮 短檢測(cè)時(shí)間，對(duì)保證食品的安全和消費(fèi)者的身體健康有著重要的意義。但是，迄今為止，市 場(chǎng)上還未見用于檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的LAMP的專用引物問世。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種特異性和靈敏度高的用于單核細(xì)胞增生李斯特 氏菌的LAMP檢測(cè)專用引物。
[0007] 本發(fā)明所提供的用于對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)的專用引物，是根 據(jù)如序列表中序列1所示的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的溶血素基因（hlyA)靶基因設(shè)計(jì)的， 用以定性檢測(cè)待測(cè)樣品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。
[0008] 具體來講，所述用于對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)的專用引物為以下 4條引物的組合，由序列表SEQ ID No. 1至序列表SEQ ID No.4所示堿基序列的寡核苷酸組 成；其中SEQ ID No.1為正向外引物，SEQ ID No.2為反向外引物，SEQ ID No.3為正向內(nèi)引 物，SEQ ID No.4為反向內(nèi)引物。詳見表1。
[0009] 表1引物序列
[0010]
[0011] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的LAMP檢測(cè)方 法。
[0012] 本發(fā)明所提供的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的LAMP檢測(cè)方法，具體包括以下步驟：
[0 013 ] 1)取待測(cè)的食品樣品2 5 g (液體食品2 5 m L )，置于2 2 5m L滅菌水中，勾漿。取勻漿液 lmL，置于9mL的Li s增菌液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)6h。
[0014] 2)取lmL菌懸液以10，OOOrpm離心lmin，棄上清。加500yL TE (pH8 · 0)重懸菌液，加 入50yL SDS(10 % )混勻，加500yL酚：氯仿：異戊醇（25 : 24:1)，劇烈震蕩，12，OOOrpm離心 10min，取上清。加等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，混勾，12,000rpm，離心lmin，取上清。加25μ L的乙酸鈉和500yL的無水乙醇，混勾，冰浴10min。12，OOOOrpm離心5min，棄去溶液，自然干 燥之后加50yL的TE溶液溶解，-20°C冷藏備用。
[0015] 3)建立LAMP反應(yīng)體系如下：
[0016]
[0017]將建立的LAMP體系放入等溫?cái)U(kuò)增儀中，設(shè)定反應(yīng)溫度63°C，反應(yīng)時(shí)間為45min。根 據(jù)擴(kuò)增曲線判定檢測(cè)結(jié)果，如出現(xiàn)擴(kuò)增曲線則為陽性檢測(cè)，如無擴(kuò)增曲線則為陰性樣品。
[0018] 本發(fā)明建立的快速檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP檢測(cè)引物及方法，本 發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有靈敏度高、特異性好，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，適用于食品安全快速檢 測(cè) 。
【附圖說明】
[0019] 圖1 LAMP特異性分析
[0020] 圖2 LAMP檢測(cè)限分析
【具體實(shí)施方式】
[0021]實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的 操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0022] 實(shí)施例1: LAMP檢測(cè)引物設(shè)計(jì)
[0023] 根據(jù)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的溶血素基因 (hlyA)為靶基因設(shè)計(jì)，利用LAMP在線 設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4(http: //primerexplorer · jp/e/)針對(duì)相對(duì)保守序列區(qū)設(shè)計(jì) LAMP引物，序列如下：
[0024] F3：CGTTGTAAAAAATGCTACTAAATCG；SPSEQ ID N0：1
[0025] B3:CGCCGAAGTTTACATTCAAAC;即SEQ ID N0:2
[0026] FIP:GCACTTACATTCGGATAAGCTTGAG-CAACGCAGTAAATACATTAGTGG;即SEQ ID NO:3
[0027] BIP:ATGATGACGAAATGGCTTACAGT-AGCTTTAAATGCAGTACCAAAT;即SEQ ID NO:4
[0028] 實(shí)施例2:樣品增菌及基因組DNA提取
[0029] 取待測(cè)的食品樣品25g(液體食品25mL)，置于225mL滅菌水中，勻漿。取勻漿液lmL， 置于9mL的Lis增菌液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)6h。取lmL菌懸液以10,000rpm離心lmin，棄上 清。加500yL TE(pH8.0)重懸菌液，加入50yL SDS( 10%)混勻，加500yL酚:氯仿：異戊醇（25: 24:1)，劇烈震蕩，12，OOOrpm離心1 Omin，取上清。加等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，混勻，12， OOOrpm，離心lmin，取上清。加25yL的乙酸鈉和500yL的無水乙醇，混勾，冰浴10min。12， OOOOrpm離心5min，棄去溶液，自然干燥之后加50yL的TE溶液溶解，-20°C冷藏備用。
[0030] 實(shí)施例3: LAMP檢測(cè)體系建立 [0031] 擴(kuò)增體系如下：
[0032]
[0033]
[0034]將建立的LAMP體系放入等溫?cái)U(kuò)增儀中，設(shè)定反應(yīng)溫度63°C，反應(yīng)時(shí)間為45min。根 據(jù)擴(kuò)增曲線判定檢測(cè)結(jié)果，如出現(xiàn)擴(kuò)增曲線則為陽性檢測(cè)，如無擴(kuò)增曲線則為陰性樣品。 [0035] 實(shí)施例4: LAMP特異性分析
[0036]分別以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157、痢疾志賀氏菌、枯草芽孢桿菌、傷寒沙門 氏菌為模板，以雙蒸水為陰性對(duì)照，對(duì)本發(fā)明的LAMP法的特異性進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖1， 5種致病菌均未出現(xiàn)陽性結(jié)果，表明本發(fā)明建立的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的LAMP方法特 異性強(qiáng)。
[0037]實(shí)施例5:檢測(cè)限分析
[0038]按照本方法提取單核細(xì)胞增生李斯特氏菌基因組DNA，對(duì)基因組DNA進(jìn)行定量分 析。然后將提取得到的基因組DNA(227ngAU)進(jìn)行10倍梯度，再以經(jīng)梯度稀釋的DNA為模板， 分別用本發(fā)明建立的LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏度檢驗(yàn)。結(jié)果如圖2所示，本方法建立的LAMP檢 測(cè)引物及方法能夠檢測(cè)到22.7fg的基因組DNA，經(jīng)本方法能夠檢測(cè)到每克食品中10個(gè)以內(nèi) 的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌污染。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的LAMP引物組，其特征在于，由序列表 SEQ ID No. 1至序列表SEQ ID No.4所示堿基序列的寡核苷酸組成；其中SEQ ID No. 1為正 向外引物，SEQ ID No.2為反向外引物，SEQ ID No.3為正向內(nèi)引物，SEQ ID No.4為反向內(nèi) 引物。2. -種食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的LAMP檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下 步驟： (1) 待測(cè)食品樣品的取樣、增菌及DNA提??； (2) 進(jìn)行LAMP反應(yīng);反應(yīng)條件為63 °C恒溫反應(yīng)45min。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中，進(jìn)行LAMP反應(yīng)時(shí)，使用的 引物為序列表SEQ ID No. 1所示的正向外引物，序列表SEQ ID No.2所示的反向外引物，序 列表SEQ ID No.3所示的正向內(nèi)引物，序列表SEQ ID No.4所示的反向內(nèi)引物。
【專利摘要】本發(fā)明名稱為食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌LAMP檢測(cè)引物及方法。本發(fā)明涉及食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，針對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的溶血素基因(hlyA)開發(fā)一套LAMP快速檢測(cè)引物，其包含有如序列表SEQ？ID？NO：1，SEQ？ID？NO：2，SEQ？ID？NO：3和SEQ？ID？NO：4所示的核苷酸序列，并建立LAMP快速檢測(cè)方法。本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于：采用本發(fā)明中的引物及方法，能夠?qū)崿F(xiàn)食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測(cè)，本方法具有快速高效、操作簡便、特異性高、靈敏性高的特點(diǎn)，可用于食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速檢測(cè)，適于推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12R1/01, C12N15/11, C12Q1/68, C12Q1/04
【公開號(hào)】CN105567864
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610154623
【發(fā)明人】謝遠(yuǎn)紅, 張紅星, 顧思宇, 賈淼
【申請(qǐng)人】北京農(nóng)學(xué)院
【公開日】2016年5月11日
【申請(qǐng)日】2016年3月18日