大豆蛋白GmAIRP1及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物技術領域，尤其設及大豆蛋白GmAIRPI及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002] 鹽堿、干旱等非生物脅迫是限制植物生長發(fā)育的主要環(huán)境因子。運些環(huán)境因子導 致植物體內發(fā)生一系列的生理代謝反應，表現(xiàn)為代謝和生長的可逆性抑制，嚴重時甚至引 起不可逆?zhèn)?，導致整個植株死亡。植物在長期的進化中，逐漸形成了一系列應答逆境脅迫 的防御機制，其中泛素/26S蛋白酶體途徑是應答脅迫的一個重要途徑。泛素連接酶E3決定 祀蛋白的特異性識別，在泛素化過程中具有至關重要的作用。
[0003] 大豆是我國重要的經(jīng)濟作物和糧食作物，干旱、鹽堿等非生物脅迫導致其產(chǎn)量和 品質均大大下降，既不能滿足國內人民生活的需求，也極大限制了大豆的出口。探究泛素/ 26S蛋白酶體途徑在大豆抵御非生物脅迫中的功能與作用機制、挖掘相關調芐基因，將有助 于推動大豆抗逆遺傳育種。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供大豆蛋白GmAIRPI及其編碼基因。
[0005] 本發(fā)明提供的蛋白，命名為GmAIRPI，是如下1)或2):
[0006] 1)序列表中序列2所示的蛋白質；
[0007] 2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白質。
[000引上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘 基的取代和/或缺失和/或添加。
[0009]編碼上述蛋白質的DNA分子也是本發(fā)明保護的范圍。
[0010] 上述DNA分子是如下1 )-3)中任一種的DNA分子：
[oow 1)編碼區(qū)為序列表中序列1所示的DNA分子；
[001^ 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質的DNA分子；
[001引 3)與1)限定的DNA序列至少具有70 %、至少具有75 %、至少具有80 %、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98%或至少具 有99 %同源性且編碼具有相同功能蛋白質的DNA分子。
[0014] 上述嚴格條件可為在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65 °C下雜交，然后用2 X SSC， 0.1 % SDS和 1 X SSC，0.1 % SDS各洗膜一次。
[0015] 含有上述DNA分子的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的 范圍。
[0016] 上述重組載體為將序列表中序列1所示的GmAIRPI基因替換表達載體PBI121的 BamHI和Sac I酶切位點間DNA片段得到的載體，命名為地1121 -GmA IRP1。
[0017] 擴增上述DNA分子全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍。
[001引上述蛋白、上述DM分子或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在調控 植物抗逆性中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；
[0019]或上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在培 育抗逆性提高轉基因植物中的應用。
[0020]上述應用中，所述抗逆性為抗鹽性;上述調控為提高。
[0021 ] 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；
[0022] 所述雙子葉植物具體為煙草。
[0023] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育抗逆性提高轉基因植物的方法。
[0024] 本發(fā)明提供的方法，為將編碼上述蛋白的DNA分子導入目的植物，獲得轉基因植 物，所述轉基因植物的抗逆性高于所述目的植物。
[0025] 上述方法中，所述抗逆性為抗鹽性。
[0026] 上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；
[0027] 所述雙子葉植物具體為煙草。
[00%]上述轉基因植物的抗鹽性高于所述目的植物體現(xiàn)在高鹽脅迫下，轉GmAIRPl煙草 的POD或CAT含量高于野生型煙草；或轉GmAIRPl煙草的MDA含量低于野生型煙草；或轉 GmAIRPl煙草長勢優(yōu)于野生型煙草。
[0029] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明克隆了一個新基因 GmAIRPl,將其轉入煙草中，得到轉 GmAIRPl煙草，用高鹽脅迫條件處理轉GmAIRPl煙草和野生型煙草，轉GmAIRPl煙草長勢優(yōu)于 野生型煙草;對兩組植株的口00八41\104、脯氨酸含量測定結果顯示，轉基因植株清除自由 基和調節(jié)滲透壓的能力總體高于野生植株，掲示GmAIRPl可能參與了植物的抗鹽調控過程， 為培育抗鹽性植物奠定基礎。
【附圖說明】
[0030] 圖1為GmAIRPl基因的RT-PCR擴增結果。
[0031] 圖2為100ymol/L ΑΒΑ誘導下GmAIRPl基因的表達模式。
[0032] 圖3為200mmol/LNaCl誘導下GmAIRPl基因的表達模式。
[0033] 圖4為農(nóng)桿菌中重組質粒的PCR鑒定。
[0034] 圖5為轉GmAIRPl煙草的PCR產(chǎn)物電泳檢測結果。
[0035] 圖6為轉GmAIRPl煙草的RT-PCR檢測。
[0036] 圖7為轉GmAIRPl煙草的發(fā)育進程。
[0037] 圖8為野生型煙草種子與轉GmAIRPl煙草種子對比。
[003引圖9為轉GmAIRPl煙草鹽脅迫下的表型分析。
[0039] 圖10為200mmol/LNaCl處理下轉GmAIRPl煙草和野生煙草中的P0D、CAT和MDA含量。
[0040] 圖11為200mmol/LNaCl處理下轉GmAIRPl煙草和野生煙草中的脯氨酸含量。
【具體實施方式】
[0041 ]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0043] 合豐45大豆(不同株型大豆群體分布對產(chǎn)量形成的影響.大豆科學，2005,29(4): 6:34-637.);
[0044] 龍江981煙草(烤煙新品種龍江981的選育及其特征特性.中國煙草科學，2015,36 (4):18-23.)
[0045] 農(nóng)桿菌菌株為EHA105(影響根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞轉化效率因素的研究. 熱帶生物學報，2012,3(1) :22-27.)
[0046] 植物表達載體質粒PBI121全長14肺，含有卡那霉素抗性，記載在如下文獻中：致病 疫霉NLP家族基因 PITG_10839的克隆和功能分析.中國農(nóng)業(yè)科學，2014,47(5):895-902。
[0047] MS培養(yǎng)基，1/2MS培養(yǎng)基，卡那霉素化an),頭抱霉素(Cef)，利福平(Rif)、6BA，NAA 等。
[004引 RNA提取試劑盒RNApr邱pure Plant Kit、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒DNA提 取試劑盒均購自天根生物有限公司；RNA反轉錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit 購自東洋紡生物有限公司；限制性內切酶BamHI和Sac I均購自肥B公司。ExTaq DNA聚合酶、 dNTP、氨節(jié)青霉素 (Amp)購自寶生物(大連)有限公司。
[0049] 實施例UGmAIRPl基因的克隆及表達模式
[(K)加]一、GmAIRPl基因的克隆
[0051 ] 利用primer premie;r5.0設計引物，并分別在引物5'端加上BamHI和SacI兩個限制 內切酶識別位點，引物序列如下：
[005。 GmAIRPl-Pl:5'CGGGATCCATGGGCGGTTGCTGTTGT 3,
[0053] BamHI
[0054] GmAIRPl-P2：GGAGCTCTTATTCAATGGGAGGGTCG [0化引 SacI
[0化6] 提取合豐45大豆的總RNA，反轉錄得到cDNA作為模板，用GmAIRPl-Pl和GmAIRPl-P2 進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。
[0化7] PCR擴增產(chǎn)物電泳結果如圖1所示，M:化2000分子量標準；1~8 :PCR擴增產(chǎn)物，得到 約64化P大小的目的條帶。
[0化引將上述PCR擴增產(chǎn)物與PMD-19T simple載體連接，轉化E.coli D冊α，通過藍白斑 篩選和PCR鑒定初步篩選出陽性克隆，對陽性克隆進行測序，結果該PCR產(chǎn)物具有序列表中 序列1所示的核巧酸，序列表中序列1所示的基因命名為GmAIRPl,該基因的開放閱讀框為序 列1第1-642位核巧酸，其編碼的蛋白命名為GmAIRPl,該蛋白的氨基酸序列為序列表中序列 2所示，該蛋白由213個氨基酸殘基組成。
[0059] 二、GmAIRPl基因在逆境脅迫和激素誘導下的表達模式分析
[0060] 1、逆境脅迫
[0061] 將合豐45大豆種子播種于賠石中，在溫度為28°C的溫室中培養(yǎng)，當幼苗長至第Ξ 片Ξ出復葉時，進行各種處理。
[0062] (1)鹽脅迫處理:在干燥的賠石中誘入含200mmol/LNaCl的化agland溶液，處理0~ 24h；
[0063] (2)ABA處理:在干燥的賠石中誘入含100ymol/L ΑΒΑ Hoagland溶液，處理0~2地。
[0064] 分別于0.化、化、1.化、3h、化、1化和24h取不同處理組的大豆葉片，用去離子水沖 洗，液氮速凍后于-80°C保存，提取RNA，反轉錄得到cDNA作為模板，進行RT-PCR。
[0065] 上述內參及目的基因引物