HER2/neu組織特異啟動(dòng)子變異體及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種經(jīng)過優(yōu)化的肥R2/neu 組織特異啟動(dòng)子變異體及其用途，該啟動(dòng)子變異體可在化r2/neu陽性細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)其下游 目的基因表達(dá)，尤其可驅(qū)動(dòng)目的基因在低氧環(huán)境下獲得更高效的表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] erbbS基因編碼產(chǎn)物是表皮生長因子受體2 (epidermal growth-factor receptor 2)，又稱肥R2/neu抗原，其胞內(nèi)段具有蛋白酪氨酸激酶活性。肥R2/neu與配體結(jié)合后可W 活化下游的多個(gè)信號(hào)途徑，包括；Ras/MAPK和PI3K/AKT，最終激活C-化S和c-jun等轉(zhuǎn)錄因 子，促進(jìn)有絲分裂，引起細(xì)胞的增殖。肥R2/neu是一種腫瘤相關(guān)抗原，過度表達(dá)在多種人類 腫瘤組織并與送些腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括乳腺癌、卵巢癌、胃腸道腫瘤、肺腺癌等。 因此祀向肥R2/neu陽性腫瘤是腫瘤生物治療的熱點(diǎn)。最顯著的是，肥R2基因是影響乳腺 癌預(yù)后的一個(gè)重要因素，大約有25 % -30 %左右的乳癌患者，受到體內(nèi)癌細(xì)胞肥R-2基因過 量表現(xiàn)的影響，他們的癌細(xì)胞不僅繁殖能力強(qiáng)，對部份化學(xué)治療藥物也容易有抗藥性，造成 病患即使接受手術(shù)治療，癌細(xì)胞仍然有較高復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的機(jī)率，無法長期存活。乳腺癌病人 可分為化r-2/neu陽性或化r-2/neu陰性兩種截然不同的預(yù)后之乳癌。肥R-2蛋白過量表 達(dá)的腫瘤生長速度較快且生物行為較為惡性，使得手術(shù)后復(fù)發(fā)率高于其他類型的乳癌。因 此，W肥R2/neu抗原為祀標(biāo)的免疫治療方案是治療化r2陽性乳腺癌的研究熱點(diǎn)，包括單克 隆抗體、肥R2/neu重組疫苗、肥R2/neu-熱休克融合蛋白、肥R2/neu致敏的樹突狀細(xì)胞疫苗 等，其中抗肥R2/neu單抗（英文名；Herceptin;赫賽汀，注射用曲妥珠單抗）已廣泛應(yīng)用于 臨床治療肥R2過度表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌和轉(zhuǎn)移性胃癌，但抗體治療的成本無疑是昂貴的， 并且對一些正常組織具有一定的毒性。因此，開發(fā)祀向肥R2/neu、毒性低、成本低廉、制備方 便、高效的生物新藥領(lǐng)域的重要課題。
[0003] 抑癌基因 （tumor suppressor gene)也稱為腫瘤抑制基因。抑癌基因的產(chǎn)物能夠 在多個(gè)環(huán)節(jié)上保護(hù)正常細(xì)胞，使其免于最終發(fā)生癌變，主要參與抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞分 化、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡和抑制細(xì)胞遷移，因此在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起負(fù)調(diào)控作用。抑癌基 因的產(chǎn)物主要包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子（如，化、p53)、負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子（WT)、周期蛋白依賴性激 酶抑制因子（如，Pl5、pl6、p21)、DNA修復(fù)因子（如BRCAUBRCA2)、與發(fā)育和干細(xì)胞增殖相 關(guān)的信號(hào)途徑組分（如，APC、Axin)、信號(hào)通路的抑制因子（如ras GTP酶活化蛋白，NF-1)， 石奔月旨酉每（phosphatase and tension homology deleted on chromosome ten gene,PTEN)) 等。腫瘤抑制蛋白Axin是一種多結(jié)構(gòu)域支架蛋白，對Wnt/目-catenin、JNK信號(hào)途徑具有 負(fù)向調(diào)控作用，還能夠活化另一個(gè)抑癌基因 p53,因此參與細(xì)胞生長、增殖、分化、癌變和調(diào) 亡等多種重要細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控過程。在許多腫瘤組織中都發(fā)現(xiàn)了 Axin異常表達(dá)和功能缺 失，如肺癌、大腸癌、乳腺癌，惡性黑素瘤等，因此Axin功能異常參與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展的 機(jī)制涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、調(diào)亡W及細(xì)胞黏附等多個(gè)方面。PTEN是具有雙特 異性磯酸酶活性的腫瘤抑制蛋白，其編碼基因在多種惡性腫瘤中發(fā)生突變或缺失，導(dǎo)致其 抑癌功能減弱或喪失，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。目前發(fā)現(xiàn)卵巢癌、乳腺癌、前列 腺癌、子宮內(nèi)膜癌、惡性膠質(zhì)瘤等存在PTEN基因的突變、缺失或低表達(dá)，從而影響其腫瘤抑 制功能。PTEN主要通過抑制PI3k/Akt/mTor信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，負(fù)向調(diào)控細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn) 移、血管形成和多藥耐藥等惡性生物學(xué)特征。因此，利用攜帶促進(jìn)野生型抑癌基因如Axin、 PTEN祀向腫瘤組織可W誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡、抑制腫瘤細(xì)胞的過度增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分 化、增加傳統(tǒng)化療藥物對相關(guān)腫瘤的化療效果，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥等，目前已經(jīng)成功 應(yīng)用于部分腫瘤的臨床研究，并取得了初步成果。然而，如何將上述抑癌基因選擇性的革己向 腫瘤組織、減少對正常組織的毒性，并在腫瘤組織中獲得優(yōu)勢表達(dá)，是腫瘤基因治療領(lǐng)域的 一個(gè)迫切需要解決的技術(shù)難題。
[0004] 解決腫瘤祀向方面的一條途徑是，通過將控制腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的啟動(dòng)子或調(diào)控 元件構(gòu)建于抗腫瘤基因的上游，使目的基因選擇性高表達(dá)在表達(dá)該腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤細(xì) 胞中，實(shí)現(xiàn)目的基因?qū)δ[瘤的抑制作用，送一方案無疑擁有潛在的臨床應(yīng)用前景。此外，研 究調(diào)控腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的啟動(dòng)子W及調(diào)控序列也對研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制具有指導(dǎo) 意義。肥R2/neu是乳腺癌等腫瘤組織特異表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原，相關(guān)文獻(xiàn)（Marion Lanteri 等，Breast Cancer Research 2005,7:R487-R494)曾報(bào)道過控制肥R2/neu 的啟動(dòng)子基因， 能夠?qū)⒕哂屑?xì)胞毒效應(yīng)的基因選擇性的祀向肥R/neu陽性的腫瘤細(xì)胞。
[0005] 腫瘤組織微環(huán)境已被公認(rèn)是促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的重要因素，其中低氧是腫瘤微環(huán)境中 的一個(gè)關(guān)鍵病理因素。低氧在腫瘤生物學(xué)中的許多方面扮演著重要的角色，包括腫瘤組織 的血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、轉(zhuǎn)移、遺傳不穩(wěn)定性、永生化和干細(xì)胞維持、免疫逃避、代 謝、PH調(diào)節(jié)和放射治療耐受等。腫瘤內(nèi)低氧是常見的并且往往是最嚴(yán)重的，正常乳腺組織的 氧分壓是65mmHg，而乳腺癌瘤內(nèi)氧分壓是lOmmHg，會(huì)增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，送一風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立于 腫瘤大小，分期，組織學(xué)分型，等級，或淋己結(jié)狀態(tài)等因素。低氧促進(jìn)腫瘤進(jìn)程的機(jī)制在于， 作為轉(zhuǎn)錄因子的低氧誘導(dǎo)因子化ypoxia-irKlucible factor, HI巧促進(jìn)腫瘤組織中的血管 生成、誘導(dǎo)免疫抑制因子基因（如ID0，TGF-目，比-10等）和癌基因（如，肥R/neu，BCR-ABL， EGFR)但失活抑癌基因（如P53, PTEN等）的表達(dá)等。因此將低氧因素考慮到啟動(dòng)子設(shè)計(jì) 方案中，使目的基因在具有低氧特征腫瘤組織中獲得優(yōu)勢表達(dá)，是提高腫瘤祀向治療效果 的一個(gè)有效手段。
[0006] 因此針對肥R2/neu陽性腫瘤細(xì)胞，改造控制肥R2/neu抗原表達(dá)的啟動(dòng)子序列，使 下游目的基因能夠在腫瘤低氧微環(huán)境下并選擇性的在肥R2/neu陽性腫瘤細(xì)胞中獲得優(yōu)勢 表達(dá)，是本發(fā)明的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種經(jīng)過優(yōu)化的肥R2/neu組織特異啟動(dòng)子變異體及其用 途。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種多核巧酸，所述的多核巧酸選自下組：
[0009] (1)核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示的多核巧酸；
[0010] (2)核巧酸序列在嚴(yán)格條件下能夠與SEQ ID NO: 1雜交且具有指導(dǎo)目的基因在 肥R2/neu陽性細(xì)胞或組織中特異性表達(dá)功能的多核巧酸；
[0011] 做核巧酸序列與（1)-似任一限定的序列互補(bǔ)的多核巧酸。
[001引在一個(gè)優(yōu)選例中，（2)或（3)所述的多核巧酸中，對應(yīng)于SEQ ID NO: 1的第156位 位置的核巧酸為C。
[0013] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的核酸，作為啟動(dòng)子元 件。
[0014] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的載體還含有與所述的核酸可操作地連接的目的基因。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因選自：能夠被轉(zhuǎn)錄成多膚的RNA分子的目的基 因，被轉(zhuǎn)錄成反義RNA分子或被轉(zhuǎn)錄成針對內(nèi)源基因的干擾RNA或miRNA的目的基因；較佳 地，所述的多膚是對于防止疾病有效的多膚，或是能指示體內(nèi)存在肥R2/neu陽性腫瘤細(xì)胞 或組織的多膚；
[0016] 較佳地，所述的目的基因選自；抑癌基因；或可W沉默或者抑制癌基因的反義核 酸或干擾RNA、或者miRNA。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因包括但不限于；Axin、PTEN等。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述相對于所述啟動(dòng)子元件，所述的目的基因是同源的或是異 源的。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的目的基因位于所述核酸的下游，且與所述啟動(dòng)子的間隔 小于lOOObp ;優(yōu)選的，小于50化P ;更優(yōu)選的，小于10化P ;如小于50bp。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是病毒載體（如腺病毒載體）。
[0021] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述的細(xì)胞：
[002引含有所述的載體；或
[0023] 其基因組中整合有外源的所述的核酸。
[0024] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組病毒，所述的重組病毒由所述的載體包裝而 成。
[0025] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的核酸的用途，用于作為啟動(dòng)子元件，指導(dǎo)目的 基因在肥R2/neu陽性細(xì)胞或組織中特異性表達(dá)；更佳地，在低氧條件下，指導(dǎo)目的基因在 肥R2/neu陽性細(xì)胞或組織中特異性表達(dá)。
[0026] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有有效量的所