GCATTTCATGT 針對SNP RS16983422的引物組： 1 GTGTAAGATGATGTAAA 2 GTCTAAATTATGTTC 3 GTTATTTGGATAGACATAG 4 TTTCTCAGCATGTGC 針對SNP RS11674786的引物組： 1 CATAAAACCTAGCTCA 2 GAACTCAAGACAGAAG 3 CTGTGGAACATGAAG 4 TTTGATGCCAAAATGC (2)PCR擴(kuò)增試劑；lOXPCR緩沖液，該P(yáng)CR緩沖液為lOOmM Tris-肥1 p冊.3,500mM KCl，15mM MgC12 ;dNTPs混合物，該dNTPs混合物為Η磯酸鳥嘿嶺脫氧核巧酸dGTP，Η磯 酸腺嘿嶺脫氧核巧酸dATP，Η磯酸胸腺嚼巧脫氧核巧酸dTTP，Η磯酸胞嚼巧脫氧核巧酸 dCTP四種核巧酸，各組分濃度為2. 5mM ;5υ/μ 1熱啟動(dòng)Taq酶。
[0011] (3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑諒脂糖、TAE緩沖液、DM分子量標(biāo)準(zhǔn)、Goldview 染色液和DM上樣緩沖液，該緩沖液W漠酪藍(lán)為指示劑稀釋至IX后使用。
[0012] 使用上述日常飲食反應(yīng)基因檢測試劑盒按如下步驟進(jìn)行檢測： (1)提取樣本基因組DNA。
[0013] 采集該測試者唾液，向l-2ml唾液樣品中加入500ul提取緩沖溶液，該DNA提取 緩沖溶液溶劑為50mM的化is-肥1 pH7. 4、0. 5mM的邸TA和50mM的化C1，反復(fù)吹打混勻 后，8000Xg離必5分鐘，棄去上清，此步驟重復(fù)一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液， 該裂解液溶劑為 50mM Tris-肥 1 pH7. 4,50mM Tris-肥 1 pH7. 4，150mM 化Cl，lmM 邸TA，1% Triton χ-100，1% Sodium deoxycholate, 0.1% SDS,蛋白酶 K20mg/mL,徹底懸浮沉淀并 充分混勻后，室溫放置30分鐘，期間來回顛倒離必管數(shù)次；得到的混合液中，加入濃度為 lOmg/mLRNA酶的水溶液10 μ L，37°C下靜置lOmin ;得到的上清液中，加入等體積苯酪-氯 仿混合溶液，苯酪和氯仿體積比為1 : 1，充分混勻，混合液4°C，12000Xg離必5分鐘，上清 液移入干凈離必管內(nèi)；加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酪、氯仿和異戊醇體積 比為25 : 24 : 1，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干凈離必管內(nèi)；加 入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000Xg離必5分鐘，上清液移入干 凈離必管內(nèi)；加入0. 6倍體積的冰浴異丙醇溶液及0. 1倍的3mol/L醋酸鋼溶液，-2(TC靜 置60分鐘后，4°C，12000 X g離必10分鐘，棄上清液；得到的沉淀物中加入0. 5血70 %己醇 清洗沉淀物，4°C，12000 X g離必5分鐘，棄上清液，此步驟重復(fù)一次；得到的沉淀物自然風(fēng) 干，加入20 μ L無菌超純水回溶，電泳檢測，-2(TC保存。
[0014] (2)PCR 擴(kuò)增 本實(shí)施例同時(shí)檢測 RS671、RS2187668、RS762551、RS4988235、RS713598、RS1800544、 RS5400、RS1726866、RS1698：M22和RS11674786。每個(gè)SNP的檢測需要一對上下游引物、兩 條多態(tài)引物共4條PCR引物，共需要40條引物。每個(gè)SNP的檢測需要做兩管PCR擴(kuò)增，為 防止出現(xiàn)假陽性之類的反應(yīng)，衡量PCR是否成功，加設(shè)一管陰性對照組，共做21管PCR，所 述陰性對照組基因組模板及反應(yīng)體系是一樣的，但沒有引物存在。
[001引根據(jù)不同的檢測位點(diǎn)，用相應(yīng)的引物按如下比例分別配制PCR反應(yīng)體系： 2.5μ 110XPCR緩沖液，2μ 1 dNTPs，0.5u 1引物組，熱啟動(dòng)Taq酶0. 15μ 1，基因組模板 80mg，添加超純水至總體積為25 μ 1。
[0016] 將裝有反應(yīng)溶液的化pendorf試管放入ΑΒΙ 9700 PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)條件如下： 預(yù)變性 95°C 3min ;熱循環(huán) 94°C 30s，6(TC 30s，72°C 30s，35 個(gè)循環(huán)；延伸 72°C 3min。反應(yīng) 結(jié)束后，取出試管。
[0017] 由于21管PCR擴(kuò)增反應(yīng)是在同一臺PCR儀上同步進(jìn)行的，為了實(shí)現(xiàn)檢測的高 效性、特異性，要求40條PCR引物的Tm值相近，為此需要先進(jìn)行大量的DNA序列軟件分析 來設(shè)計(jì)PCR引物，并通過大量的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行Tm值的優(yōu)化并確定設(shè)計(jì)的合理性，本試劑盒各 基因 SNP多態(tài)性的檢測是既相對獨(dú)立又相互聯(lián)系的，不可分割。
[001引（3 )瓊脂糖凝膠電泳檢測 將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，過程如下；3g瓊脂糖，加入lOOmL去離子水，微 波爐加熱Imin，冷卻到6(TC時(shí)加入5 μ L Goldview染色液，制成3%的瓊脂糖凝膠。PCR產(chǎn) 物10 μ L與6 X T邸緩沖液0. 8 μ L混合上樣，電壓100V電泳15min。紫外燈下讀取結(jié)果并 拍照，所得瓊脂糖電泳檢測圖如圖1所示。
[0019] 檢測得到10個(gè)基因分型結(jié)果如下：
W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則 之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.日常飲食反應(yīng)基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑，其特征在于： 存放的試劑包括： (1)針對10個(gè)基因 SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組（以下引物序列方向均為5'端至 3,端）： 針對SNP RS671的引物組： 1 CTGCAGGCATACACTA 2 CACAGTTTTCACTTC 3 CCAAGAGTGATTTCTGC 4 GCAGGTCCTGAACTTCCAG 針對SNP RS2187668的引物組： 1 GGCAGCTGAGAGTAAA 2 CCACATGGTCCTCAC 3 GTGAAGCTATATCTGTAATAG 4 GAAGTGTCATTCTC 針對SNP RS762551的引物組： 1 GTGAGCTCTGTGGGCA 2 CATCTACCATGCGTCCTGG 3 GCATGCATGCTGTGCCAG 4 GACTGGGACAATGCCATC 針對SNP RS4988235的引物組： 1 CAGATAAGATAATGTAGC 2 GTTCCTTTGAGGCCAGGGA 3 GAGACGATCACGTCATAG 4 CAAACCCCCTTTTCAAAG 針對SNP RS713598的引物組： 1 CAATCACTGTTGCTCAGTGC 2 GTAGTGAAGAGGCAGC 3 GACTCTAACTCGCATC 4 GGAAGGTGTGAGAGAAAC 針對SNP RS1800544的引物組： 1 CTGCTCCGTCGGCCCC 2 GTTGGCCATGCAGCTCC 3 CTCCAGACGTAACTCACAC 4 CAAGCGTTGCTGAG 針對SNP RS5400的引物組： 1 GCAGTTGGTGGAATGAC 2 CCAAAGAATGATGCAA 3 TGGATGACCGAAAAG 4 ATGCGCATAGGGTCATG 針對SNP RSI726866的引物組： 1 GTGATATCATCCTGTGC 2 CACAGAGATGAAGGCAA 3 CTCTTCTGCTATCTGTG 4 AAGAGGCATTTCATGT 針對SNP RS16983422的引物組： 1 GTGTAAGATGATGTAAA 2 GTCTAAATTATGTTC 3 GTTATTTGGATAGACATAG 4 TTTCTCAGCATGTGC 針對SNP RS11674786的引物組： 1 CATAAAACCTAGCTCA 2 GAACTCAAGACAGAAG 3 CTGTGGAACATGAAG 4 TTTGATGCCAAAATGC (2) PCR擴(kuò)增試劑； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的日常飲食反應(yīng)基因檢測試劑盒，其特征在于：所述引物用量 均為 〇. 5-1. Ο μ 1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的日常飲食反應(yīng)基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增 試劑包括：l〇XPCR緩沖液，dNTPs，熱啟動(dòng)Taq酶，基因組模板。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的日常飲食反應(yīng)基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR緩沖 液包含：100mM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl，15mM MgCl2。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的日常飲食反應(yīng)基因檢測試劑盒，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增 試劑用量為：l〇XPCR緩沖液2. 5μ 1，dNTPs2l·! 1，熱啟動(dòng)Taq酶0. 1-0. 2μ 1，基因組模板 50-100ng〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的日常飲食反應(yīng)基因檢測試劑盒，其特征在于：所述瓊脂糖凝 膠電泳分析試劑包括：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA無毒染料和DNA上樣緩 沖液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的日常飲食反應(yīng)基因檢測試劑盒，其特征在于：所述DNA無毒 染料優(yōu)選Biotium Gelred無毒染料。
【專利摘要】本發(fā)明提供了人體對日常飲食反應(yīng)的基因檢測試劑盒，該試劑盒包括盒體及盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑，試劑包括：（1）針對10個(gè)基因SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組（2）PCR擴(kuò)增試劑（3）瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。本發(fā)明通過PCR引物的設(shè)計(jì)使多個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)可在同一臺PCR儀上同步進(jìn)行，對受測者的相關(guān)基因進(jìn)行檢測，并實(shí)現(xiàn)檢測的高效性、特異性，分析得到不同營養(yǎng)元素對身體影響的基因基礎(chǔ)，從而為受測者獲得一個(gè)合適的飲食管理方案，評估相應(yīng)健康風(fēng)險(xiǎn)，采取相應(yīng)的策略避免對其無效甚至是有害的方法。同時(shí)可以輔助專業(yè)教練員對運(yùn)動(dòng)員的飲食管理。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105586395
【申請?zhí)枴緾N201410651957
【發(fā)明人】李則軒, 朱軼凡, 邱嘉銘, 張舒, 張靜靜, 別茜
【申請人】武漢白原科技有限公司
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2014年11月17日